蛋白质荧光染色技术.ppt

中英联合实验室 第七章 定量蛋白质组学研究技术 蛋白质组的提出至今，新技术更是层出不穷。如多维色谱-质谱联用技术、蛋白质荧光染色技术、蛋白质芯片技术、同位素标记技术、同位素亲和标签技术等。这些新技术的使用突破了常规2DE-MS分析途径本身所固有的局限性，提高了分析的重复性、灵敏度、准确性。这些极大促进了生命科学的发展。 定量蛋白质组学 (quantitative proteomics): 顾名思义，就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。 第一节 利用荧光染料进行 定量的蛋白质组分析技术 适用于检测蛋自质的荧光染料有两类: 一种类是用于蛋白质荧光染色，如Sypro Ruby 和 RuBS 另一类用于蛋白质的荧光标记，如Cy2,Cy3和Cy5,可进行荧光双向差示凝胶电泳。 第二节 运用质谱进行定量的蛋白质组分析技木 一.稳定同位素代谢标记技术 该方法由Oda提出,其具体作法是，如在两组酵母细胞平行生长的培养基中，一组含有天然氮同位素组分(14N，99.6％；15N，0.4％)；另一组基质相同，但富含15N(＞96％)。经过一段时间培养后,将细胞裂解，然后将这两组蛋白质等量混合，通过凝胶电泳分离和染色后，找出差异表达蛋白质，将其从凝胶中挖出，酶解后，用MAIDI-TOF分析。 二.同位素亲和标签技术 该技术由 Gygi提出，主要是使用了一种称为ICAT的化学试剂。 其结构由三部分组成： 第一 亲和标签（生物素），用来分离经标 记后的多肽； 第二 连接子，用来整合稳定的同位素； 第三 活性基团，用来特异结合巯基。 试剂有两种形式，称为“重”和“轻”  Examples of Real Data using ICAT 优点：ICAT具有广泛的兼容性 主要表现在： 第一.能够兼容分析任何条件下体液、细胞 组织中绝大部分蛋白质； 第二.烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂 (如尿素、盐酸胍等)存在下都可进行； 第三.只需分析含cys残基的肽段，从而降低 了蛋白混合物分析的复杂性； 第四.允许任何类型的生化、免疫、物理的分 离法．因此能很好地定量分析微量蛋白质。 当然， ICAT技术依然存在一些问题： 首先:ICAT的相对分子质量约为500 Da，这对 肽段来说已经是一个很大的修饰物，这 会增加数据库搜索算法的复杂性、对一 些小的肽段(小于7个氨基酸)更是如此。 其次:这一方法无法分析不含cys的蛋白。 传统的技术 传统的对蛋白质组研究的途径是分离—鉴定。对一个蛋白质混合体系，首先用二维凝胶电泳进行分离，然后对蛋白质点进行染色，最后通过比较蛋白点染色强度，对其进行定量分析。 理想的染色方法必须有以下几个特点： 1.具有良好的线性范围 2.具有好的通用性 3.具有高的灵敏度 4.染色不影响后续的鉴定过程 但是 1. 采用考马斯亮蓝染色法或银染法，都不能 完全符合上述的几点特征，也就不能准确 地应用于定量蛋白质组学研究; 2. 质谱只应用于对未知蛋白点的鉴定，而不能 应用于对蛋白质点的定量分析，这是因为不 同的蛋白质或多肽具有不同的离子化能力， 所以不能够通过质谱图对蛋白质或多肽进行 定量分析。 新的技术 1.荧光染色（标记）技术与考马斯亮蓝染色 法或银染法相比，能更好满足于上述几点 要求，从而能够应用于定量蛋白质组学研究 2.稳定同位素代谢标记的方法和同位素亲和 标签技术巧妙解决了质谱仪不能应用于对 蛋白质点的定量分析的缺点 Amersham 2D-DIGE The labelling can also be achieved by digesting two protein sample with trypsin in 18O and 16O water Cell States Normal vs. Diseased Aerobic cells vs. Anaerobic cells,etc. Lyse cell and digest with trypsin Avidin-Biotin Separation Single MS Analyze peptide peak ratios MS/MS Obtain sequence info MS MS/MS