DNA文库的构建和目的基因.pptVIP

* 二、基因文库的鉴定 限制性核酸内切酶分析 当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒DNA，然后用已知的内切酶进行酶切，酶切进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现与预知的大小一致的电泳片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。 * 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 PCR扩增片段 * * 2 Southern Blotting 这种方法是E.M.Southern于1975年建立的，它是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，经常用于对原位杂交所得到的阳性克隆进一步分析，这种方法包括两部分内容： ①将DNA的限制性核酸内切酶的酶切片段从琼脂糖凝胶上转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上； ②用各种标记的DNA探针同固定在膜上的DNA片段杂交，经放射自显影或其它显色方法确定出与探针互补的电泳带。 * * 作业: 1. 简述基因克隆的筛选策略。 2. 描述cDNA文库构建过程。 3. 总结实时定量PCR的原理和方法。 * 1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列