重组克隆鉴定与融合蛋白质表达、纯化、分析.pptVIP

第一天 1.小量质粒DNA提取 2.克隆的重组DNA限制酶切鉴定 3.选定克隆的菌液的离心处理和冻存 第二天 1.SDS胶的制备 2.纯化表达的6-His融合蛋白 3.电泳样品的制备 4.SDS电泳 5.小鼠肝脏过夜消化 第三天 1. SDS胶的银染显示 2.凝胶的干燥保存 3.小鼠基因组DNA的提取 质粒DNA提取 isolation of Plasmid DNA 1、细菌培养：（实验老师准备） 取试管数只，各加入3ml 含四环素就（10 ug/ml）氨苄青霉素（100 ug/ml）的SOB培养液，从转化的细菌培养皿上分别取单一菌落（3个无绿色荧光；1个有绿色荧光），加入各管中，于37℃ 230rpm振摇过夜培养。 2.质粒的提取 （1）取菌液（两种）各1.0 mL于离心管中，12 000r/min离心1min去掉上清液。 （2）于紫外灯下观察沉淀绿色荧光发光情况并记录。 （3）加入100μL 的质粒提取液，充分混悬细菌。 （4）再各加入等体积（100μL）苯酚/氯仿，震荡混匀，15000r/min离心5 min，将上层水相转移至新的离心管中。 （5）各加入两倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温放置2 min。15000 r/min离心5 min，去上清。 （6）加300μL 70%乙醇，颠倒混匀， 15000 r/min离心2 min。仔细去上清液，晾干，加入20μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。 限制酶切鉴定重组质粒Identification of recombinant Plasmid by Restriction Digestion 1、限制酶切 每管反应体积20μl，每管加提取的质粒DNA液10μl，再加入酶切反应混合液10μl。 混匀后置37℃温浴1小时。 DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 电泳结果 取两只1.5 ml的离心管，从选定的空载体和重组体中取1 ml菌液，标记为空载体和重组体。12000rpm离心1min,去净上清。 加入1 ml含四环素和氨苄青霉素的SOB培养液，悬浮细菌后将液体转移至100 ml的含四环素和氨苄青霉素的SOB培养液，过夜37 ℃230 rpm振摇培养。次日早，加入IPTG至终浓度为0.1 mM，继续培养3-4小时。 6-His融合蛋白的分离纯化Isolation and Purification of 6-His -Fusionsprotein 1. 取1.5 mL离心管4支，分别标记为1～4号管。1、2号管中各加入发绿色荧光的菌液1 mL，3、4号管中各加入含正向重组质粒的菌液1 mL。15 000 r/min离心1 min，去上清。 2. 向1、3号管中各加入400 μL的1×SDS电泳上样缓冲液，悬浮细菌，95 ℃加热15 min，然后室温15 000 r/min离心10 min，备电泳用。 His*Bind Resin预处理： 临用前，取两支新的1.5 mL离心管，分别标记为5号和6号，将His*Bind Resin瓶轻轻振摇悬浮His*Bind Resin颗粒，将一个200 μL移液器吸头尖剪去0.5 cm，向上述两只管子中各移入100 μL 的His*Bind Resin悬液，3 000 r/min离心1 min，吸去上清。 按以下条件进行清洗、上载镍离子、平衡，每次进行His*Bind Resin悬浮，放置2 min，离心去上清：250 μL蒸馏水清洗，2次；250 μL Charge buffer上载镍离子，2次；250 μL Wash buffer 平衡，2次。注意：每次去除上清时，需要使用200 μL移液器操作，并且小心避免吸走His*Bind Resin颗粒。 3. 裂解细菌：（从此步骤起，直至纯化结束的每一步操作都要用紫外灯照射离心管，并观察记录绿色荧光在管内的部位和去向。）向2号和4号管沉淀中，各加入100 μL含溶菌酶的细菌裂解液，悬浮细菌，于室温放置10 min。 室温15 000 r/min 离心10 min，将上清液分别用200 μL 移液器转移入以上处理的5 号、6号管中。 2、4管中各加入100 μL 4×SDS上样缓冲液， 悬浮溶解沉淀，95 ℃ 加热15 min，然后室温15 000 r/min离心10 min后备电泳用。 4. 6His融合蛋白的纯化： 将步骤（3）的5号和6号管，轻轻混悬His*Bind Resin，然后微型平板振荡器上振摇5 min；3 000 r/min离心1 min，上清分别转移入两只新管中（7号和8 号管）。 向His*Bind Resin沉淀加200 μL Wash bu