第八章 电泳讲义.pptVIP

第八章 电泳分离技术 一、电泳概念 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （三）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）样品的浓缩效应 （2）凝胶的分子筛效应 （3）电荷效应 （1）样品的浓缩效应 电泳介质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离 。 ①、凝胶层的不连续性 ②缓冲离子成分的不连续性 三种负离子（快离子、慢离子和蛋白质）移动速度相同时，则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 ②、分子筛效应（浓缩胶没有） 分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率。 样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的，电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。 在蛋白质样品进入分离胶时，慢离子跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使蛋白质进入到均一电势梯度和pH的分离胶中。 （四）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 （五）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、原理 引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电荷的10倍，消除了蛋白质原有电荷的影响。 三、影响电泳分离的因素 （一）、被分离物质的本性（内部因素） 1、结构（形状） 2、电荷 3、大小 （二）、外部因素 1、支持介质 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 2、缓冲液 3、电场强度 三、琼脂糖凝胶电泳 3、琼脂糖凝胶电泳的原理 4、琼脂糖凝胶的染色 四、等电聚焦电泳 （isoelectrofocusing,IEF或EF） 3、载体两性电解质商品 (1)、Ampholine(瑞典LKB公司) (2)、Pharmlyte(瑞典Pharmacia公司) (3)、Serralyte(德国Serva公司) (4)、国产 Ampholine ①、合成 由许多脂肪族的多氨基多羧酸的异构体和同系物组成，具有很多既不相同又互相接近的等电点。 pH范围：3-10 ②、pH梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物，在通电后它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。 b、溶液中的两性电解质影响周围环境，使其pH值有所改变。 （3）、载体两性电解质必需具备的条件 ①、缓冲能力强：保证pH梯度的稳定； 4、等电聚焦的优点 5、等电聚焦的缺点 ①、等电聚焦不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。 6、等电聚焦的支持介质 作用：防止扩散、抗对流； （1）蛋白质等电点的测定； （2）蛋白质的分离。 实例：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 （1）制胶 （2）电泳 （3）蛋白质的染色和脱色 将未染色胶条放在玻板上，从凝胶的正级端开始，每隔0.5cm切下一段，用水浸泡后，测定浸泡液的pH，以凝胶长度（距正极的长度）为横坐标，pH为纵坐标，绘制pH-cm标准曲线。 五、双向电泳（Two dimensional Electrophoresis,2-DE） 1、应用 蛋白质组学研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。 2、定义 将样品进行电泳后，在它的直角方向再进行一次电泳。 3、原理 第一向：等电聚焦，按照pI分离 第二向：SDS，按照分子大小分离 4、应用举例 双向电泳技术在筛选膀胱癌特异标志蛋白中的应用。 1、 （1）溴化乙锭（EB）染色EB是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。溴化乙锭与DNA结合形成的复合物在紫外照射下能发射红色荧光。 （2）Goldview：绿色荧光 （3）GelRed：红色荧光 pH=3 pH=10 负极 正极 1、等电聚焦电泳的定义 利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的技术。 2、原理 （1）在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度； （2）蛋白质是两性电解质，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即迁移并聚焦于相应的等电点位置上。 pH=3 pH=10 负极 正极 pIA pIB 样品：A、B和C 的混合物 pIC pH梯度：不管蛋白质分子的原始分布如何，蛋白质聚焦在等电点位置。 某蛋白质的pI=5.6，进行等电聚焦电泳时 （1）目前常用的载体两性电解质商品 -CH2-N-（CH2）x-N-CH2- （CH2）x （CH2）x C00H NR2 R=H或者 （CH2）x-COOH X=2或3 ampholine的结构式 + - + - 3 10 没通电时 通电后 a、溶液的pH决定两性电解质的带