生化工程实习..pptVIP

生化工程實習 (PROTEIN) 實驗二 蛋白質分子量測定- SDS-聚丙 烯醯胺凝膠電泳 一、實驗目的： 1.學習SDS測定蛋白質分子量的原理 2.掌握SDS測定蛋白質分子量的操作 方法 二、實驗原理： 1.Stoke’s 方程式 2.電泳只需兩件儀器： (1).直流電源 (2).緩衝劑容器(貯池)系 3.SDS是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負 電荷的陰離子去污劑。 4.各種蛋白質分子在SDS中，只能按其分子 量大小而分離。 5.電泳技術的廣泛應用已需要發展一種方法來用 在看見大分子在丙烯醯胺膠上分離，方法如 下： (1).Coomassie 亮藍染色 (2).螢光染色技術 三、實驗儀器： 1. 夾心式垂直板電泳槽[凝膠模 (135×100×1.5mm)] 2. 直流穩壓電源(電壓 300~600V，電流 50~100mA) 四、實驗藥品及試劑： 1.分子量測定標準蛋白質 2.連續體系SDS有關試劑 (1).0.2M pH 7.2 磷酸鹽緩衝液： (2).樣品溶解液： (3).凝膠貯液： (4).凝膠緩衝液： (5).1% TEMED： (6).10% 過硫酸銨(AP)： (7).電極緩衝液(0.1% SDS，0.1M PH 7.2 磷酸鹽緩衝液)： (8).1%瓊脂醣： 3.不連續體系SDS有關試劑 (1).10%(W/V)SDS溶液： (2).1% TEMED(V/V)： (3).10% 過硫酸銨(AP)(W/V)： (4).樣品溶解液： (5).凝膠貯液： (6).凝膠緩衝液： (7).電極緩衝液(內含0.1% SDS，0.05M Tris-0.384M甘胺酸緩衝液 PH 8.3)： (8).1%瓊脂醣： 4.固定液： 5.染色液： 6.脫色液： 五、實驗步驟： (一)、實驗步驟(一)： 1.?安裝夾心式垂直板電泳槽 2. 配膠及凝膠板的製備 (1).配膠 (2).凝膠板的製備 3.樣品的處理與加樣 (1).樣品的處理 (2).加樣 4.電泳 5.凝膠板剝離與固定 6.染色與脫色 7.繪製標準曲線 (二)、實驗步驟(二)： ※蛋白質電泳-1 1.養菌 菌液(100?L)+LB(100mL)+Amp(100?L)+IPTG(100?L) (1).配製培養基200mL – 利用250mL錐形瓶 (2).調整PH值 (PH=7.0) (3).分裝於2瓶錐形瓶(每瓶錐形瓶100mL)，並 於每瓶錐形瓶用鋁鉑封口。 (4).置於滅菌鍋滅菌，操作時間約1小時 (5).滅完菌後，取出冷卻 (6).於錐形瓶中加入100?L的菌種、100?L的Amp 及100?L IPTG.(於無菌操作台操作) (7).置於恆溫振盪器中培養16小時 ※蛋白質電泳-2 1.養菌：菌液(100?L) + LB(100mL) +Amp(100?L)+ IPTG(100?L) 2.離心，上層液不要，取下層沈澱物。 3.每支有沈澱物的離心管中加5mL磷酸緩衝液 (Pi buffer)溶解沈澱物[用玻棒溶解沈澱物] 4.溶解沈澱物均勻後，利用超音波震破機震破 細胞的細胞壁[若酵素為胞外酵素，則不需此 程序；若酵素為胞內酵素，則需此程序將沈 澱物震破，以能取出胞內酵素] 5.震破完後，離心，取上層液(即為酵素液)[而 下層為細胞壁的殘骸，則滅菌後丟棄] 6.上層液，測酵素活性： (1).活性測試法： ?.先取5支1.5mL的離心管，每支加入200uL膠狀 chitin。 ?.離心完成後，先在2~5支加入800uL上層液(酵 素液)，將2~5置入37℃恆溫槽(維持酵素有活 性)，並開始記時。 ?.而第1支(當Blank用)則加入800uL的上層液 (酵素液)，並加入200uL的DNS溶液，置入 95℃恆溫槽(破壞酵素活性)，反應10min。 ?.其餘2~5支置入37℃恆溫槽，每30分鐘取1支