磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C在细胞凋亡与分化中的作用机制分析-发育生物学专业论文.docxVIP

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：趋盔圭 Et期：垫!±：生碰 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：龇导师签名：薹堡蒸日期：翌堕竺地 中文摘要 中文摘要 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C 在细胞凋亡与分化中的作用机制研究 目的： 本课题研究人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中，由去除生长因子诱导的、 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC—PLC)介导的细胞凋亡与分化信号转导中有 哪些胞内物质参与这条通路；在体外建立一种骨髓基质细胞(BMSCs)分离 培养的方法，并初步探讨PC．PLC在去除血清培养的BMSCs以及正常培养的 人肺癌A549细胞分化中的作用。 方法： 以下实验利用PC—PLC的特异性抑制剂D609(tricyclodeean一9一yl—xanthogenate) 作为研究工具。 1、对血管内皮细胞(VECs)的研究：本课题从新生牛脑纯化成纤维细胞生长 因子(FGF)，从健康产妇的新鲜脐带分离VECs。实验分组：正常组，正常 培养在含血清和FGF的M199培养液中的细胞；凋亡组，去除血清和FGF的 M199培养液培养的被诱导凋亡的细胞：D609处理组，去除血清和FGF加入 D609的M199培养液培养的细胞。倒置显微镜下比较上述三组细胞的形态变 化：将正常培养的细胞与去除血清和FGF同时加入D609两组细胞加入抗NSE 和GFAP抗体用免疫细胞化学的方法进行碱性磷酸酶染色后，普通光学显微 镜观察结果；提取cAMP，用放射免疫试剂盒在v．计数仪上测定cAMP含量； 加入抗p53、Bcl．2和Ras的抗体用免疫细胞化学的方法进行荧光染色，激光 扫描共聚焦显微镜进行定性与定量分析；流式细胞仪分析细胞凋亡率和周期 的变化，通过以上的实验，分析去除生长因子情况下，PC-PLC介导的VECs 凋亡与分化信号转导。 2、对骨髓基质细胞的研究：用骨髓穿刺针自健康成人髋骨大粗隆部穿刺取得 BMSCs，用添加了10％tJ,牛血清的M199培养液培养，待长成单层细胞以后 传代。比较正常培养的、去除血清和去除血清加入D609三组细胞形态变化， 山东大学硕士学位论文将正常培养的细胞与去除血清加入D609两组细胞加入NSE和GFAP抗体用 山东大学硕士学位论文 将正常培养的细胞与去除血清加入D609两组细胞加入NSE和GFAP抗体用 免疫细胞化学的方法进行碱性磷酸酶染色后，普通光学显微镜观察结果，初 步分析PC．PLC在去除血清的BMSCs中的作用。 3、对人肺癌A549细胞的研究：倒置显微镜下比较正常培养的和正常培养的 同时加入D609两组细胞形态变化，用流式细胞仪分析细胞周期的变化，通过 以上的实验，初步分析PC．PLC在人肺癌A549细胞中的作用。 结果： 1、正常生长的VECs为三角形或短梭形；凋亡组细胞发生明显的凋亡现象， 凋亡小体明显可见；D609处理组，细胞凋亡被抑制，同时细胞变成神经细胞 样，免疫细胞化学染色表明：30％细胞表现为NSE阳性深蓝色染色，对照组 无阳性细胞出现，GFAP免疫组化显示无阳性细胞。自动放射仪上测定cAMP 含量，结果显示，凋亡组cAMP的含量(40nM／106个细胞)比正常组的(60nM／106 个细胞)明显降低，D609处理组(20nM／106个细胞)比凋亡组含量明显降低。p53 蛋白检测表明：细胞凋亡时，表达明显增加，凋亡被抑制时，表达明显较少 到正常组水平；Bcl一2蛋白检测：细胞凋亡时，表达明显减少，凋亡被抑制时， 表达水平保持不变；Ras蛋白检测：细胞凋亡时，表达明显减少，凋亡被抑制 时，表达明显增加到正常组水平。流式细胞仪检测结果表明凋亡率发生了很 大变化，凋亡组，凋亡率增加；D609处理组比凋亡组减小，细胞周期的分布： 当细胞凋亡时，与正常组比S期细胞减少。G2／M期细胞增多；当凋亡被D609 抑制时，与凋亡组比s期细胞增加，G2／M期细胞数目减少。这些结果表明 cAMP、p53、Ras参与这条通路，Bcl．2可能不参与这条通路。Pc—PLC可能 通过调节