翟中和细胞生物学课件 第3章细胞生物学研究方法.pptx

第二章小结;第3章 细胞生物学研究方法;;Caenorhabditis elegans;研究技术、研究工具;本章主要内容;病毒 20-200 nm 支原体 0.1-0.3 μm 细菌 0.5-5.0 μm 动植物细胞 20-30 μm 活细胞多是无色透明的; 显微镜观察范围 肉眼观察范围;肉眼 0.2 mm 光学显微镜 0.2 μm 电子显微镜 0.2 nm 扫描隧道显微镜 样品制备技术;一、光学显微镜 (light microscope);（一）普通复式光学显微镜——组成;（一）普通复式光学显微镜——成像;（一）普通复式光学显微镜——分辨率;甲醛;发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;微分干涉相差显微镜 （DIC）;Four types of light microscopy;正置显微镜与倒置显微镜比较;（三）荧光显微镜—实物;（三）荧光显微镜——基本原理;特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜； 2 .核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。;（三）荧光显微镜——样品制备;（三）荧光显微镜——应用;共聚焦显微镜及其显微图像;（四）激光扫描共焦显微镜;（四）激光扫描共焦显微镜;荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）;蓝色为细胞核，绿色为微管 ;透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM;（一）透射电子显微镜—特点;显微镜;2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数;3．电子显微镜的基本构造;（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术;超薄切片机;超薄切片技术显示的细胞超微结构;用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。 **负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。;（二）透射电镜制样技术——负染色技术;（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术;冰冻蚀刻电镜照片—细胞断裂面结构 ;透射电镜照片与冰冻断裂 和冰冻蚀刻电镜照片比较;电镜三维重构与低温电镜技术;（三）扫描电镜技术;（三）扫描电镜技术;Red blood cell ;小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较;三、扫描隧道显微镜;正置显微镜与倒置显微镜比较;第二节 细胞及其组分的分析方法;一、用超离心技术分离细胞组分;一、用超离心技术分离细胞组分;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;用超速离心技术分离细胞组分;二、细胞成分的细胞化学显示方法;福尔根反应 Feulgen stain;DNA Feulgen反应;三、特异蛋白抗原的定位与定性;抗原：能刺激机体产生抗体的物质。;免疫荧光技术： 将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。;（一）免疫荧光技术;免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架;将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。;（二）免疫电镜技术;四、细胞内特异核酸的定位与定性;原位杂交技术;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ;五、定量细胞化学分析与细胞分选技术;排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度； 仪器使带有荧光细胞的小水滴充电； 带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞； 未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转。; 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。;第三节 细胞培养与细胞工程; 细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。 ; 体外培养的动物细胞可分为;;肿瘤细胞失去接触抑制行为