第六章重组体克隆的筛选和鉴定.pptVIP

第六章 重组体克隆的筛选和鉴定 第一节 载体表型选择法 pBR322 2. pBR322抗菌素标记选择 3. 选择过程： （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 2. 选择过程 第二节外源基因的表型选择 2. 增加新性状 第三节 DNA电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 不同克隆的酶切结果 筛选过程 三、PCR扩增检测法 第四节 核酸杂交检测法 二、核酸杂交检测方法 Southern blot 筛选结果 （1）原位杂交筛选 （2）R-环检测法 2. Northern blotting 第五节 免疫化学检测法 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 二、免疫沉淀检测法 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （2）一抗结合 （3）二抗结合 （4）显色反应 （5）比色 3.ELISA的局限性 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹（western blotting）法 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： 直接染色电泳结果 （2）Western blotting Western装置 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 第六节 转译筛选法 二、转译筛选 三、杂交抑制转译法 2. 过程 四、杂交释放转译法 2. 过程 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 ④胸苷酸激酶的补救作用 （2）TK选择过程 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） DHFR+细胞 DHFR- 细胞 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 （2）选择过程 3. 新霉素抗性基因（neor） ③ 新霉素抗性基因--neor （2）选择过程 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT） （5） CAT分析方法 二、植物转化体报道基因筛选法 2. 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA编 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。 dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 ① HAT培养基： Tk- 细胞株。 TK基因。 ② 宿主细胞 ③ 载体标记 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） 只有转入TK基因的细胞才能生存。 20 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 需要补救！ 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。 dUMP dATP TTP