第十三章 高等植物基因工程.pptVIP

第一节 植物基因工程发展现状 第二节 植物基因工程方法 一 、植物遗传转化的方法　　植物遗传转化技术可分为两大类： （一）生物介导的转化方法 主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 （二）直接基因转移技术 包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转 化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。 1、农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。 Ti质粒（Tumor induced plasmid） T-DNA T-DNA长约23kb（ 15kb-30kb ） ，共有三套基因： Auxin Cytokinin Opine 合成的植物生长素与细胞分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。 Ti质粒（Tumor induced plasmid） 环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 毒性区（Vir）（Virulence region) ：直接参与 T-DNA的转移和插入植物染色体 DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制 根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化分子机理 整个过程分为以下6个步骤： 1）农杆菌对受体的识别 2）农杆菌附着到受体细胞 3）诱导和启动毒性区基因表达 4）类似接合孔复合体的合成和装配 5）T-DNA的加工和转运 6）T-DNA与受体基因的整合 Ti质粒作为载体的优点 宿主范围广，能转化所有的双子叶植物 整合到染色体上后成为染色体的正常组分永远保留 冠瘿碱合成酶基因启动子是一个强启动子 Ti质粒的改造策略 天然的Ti质粒不能作为表达载体使用的原因：　　a. 植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素，阻止了生长在培养基上的细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。　　b. 有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）。 　　c. Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。  d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。 Ti质粒的改造 为了使重组质粒DNA的大量扩增，添加大肠杆菌复制子； 加入植物细胞的筛选标记，如neor基因（新霉素磷酸转移酶基因 ）； 使用植物细胞启动子及末端polyA化信号； 加入多聚人工接头以利于外源基因的克隆。  植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。 用于植物基因转化的Ti质粒载体系统 一元载体系统/共整合载体系统 双元载体系统 一元载体系统 共整合系统（一元载体系统）要点 1、Ti质粒进行卸甲处理。 2、将目的基因构建于中间载体上。 3、在卸甲载体T-DNA区插入一段与中间载体同源的质粒序列。 4、然后将中间载体转移到含有卸甲载体的 根癌农杆菌中，中间载体通过同源重组整合到卸甲载体的T-DNA区，并与卸甲Ti质粒一起复制。 5、根据中间载体上所携带的抗性基因进行抗性筛选，获得遗传重组根癌农杆菌菌株。 6、使用这种菌株去侵染植物组织细胞，就可以获得含有目的基因的转基因植物。 二元载体系统 二元载体系统（双元载体系统）要点 1、微型Ti质粒缺失Vir区，T-DNA区进行卸甲处理； 2、引入多个酶切位点和广谱的复制元件； 3、把外源基因重组于微型Ti质粒上； 4、辅助质粒去掉T-DNA区， Vir区仍然存在； 5、把微型质粒转入含有辅助质粒的根癌农杆菌中，随后侵染植物组织； 6、两种Ti质粒可通过反式作用将含有外源基因的T-DNA区转移到植物组织 细胞中。 （2）共培养 农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌