原核生物的基因表达跟操作文档.pptVIP

3 原核生物的基因表达与操作 3.1 原核生物的基因表达 3.2 有功能的启动子的分离 3.3 可调控强启动子驱动的基因表达 3.4 原核生物表达产物的分离纯化 3.3 可调控强启动子驱动的基因表达 3.3.1 可调控的启动子 3.3.2 常用原核表达载体 3.3.3 提高蛋白的表达量 3.3.6 非融合蛋白的表达 3.3.7 融合蛋白的表达及纯化 3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中 3.3.11 加强分泌 非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法： 1、选用Ion-（黄嘌呤核苷）营养缺陷 型宿主菌 2、利用细菌蛋白酶抑制剂 融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA 序列或其他DNA序列编码，C端由 真核DNA的完整序列编码。这样 的蛋白质有一段短的原核多肽或 具有其他功能的多肽和真核蛋白 质结合在一起，故称为融合蛋白。 3.3.7 融合蛋白的表达及纯化 融合型蛋白表达 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 融合蛋白的表达及纯化 1、构建融合蛋白表达载体：在外源蛋白的N或C端加标记物（如谷胱甘肽S-转移酶标记物、6×组氨酸标记物、Flag或HA肽段标记物、CBP标记物等）；在标记物和外源蛋白之间插入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列。 2、转化原核细胞并诱导表达 3、裂解细胞，亲和柱层析分离融合蛋白 4、切割融合蛋白获得目的蛋白 主要步骤： 例：谷胱甘肽S-转移酶标记物 融合蛋白质的纯化的基本原理： 利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。 融合蛋白质中目的蛋白的纯化 1.溴化氰（CNBr）切割法： 能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。如 胰岛素的制备。 2.胰蛋白酶切割法： 能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异 性的切割。 3.凝血因子Xa切割法： 能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽 3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中 3.3.11 加强分泌 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位: 1. 细胞质中表达 2. 周质中表达 3. 胞外表达 1、细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包含体。 包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分 优点： 1. 形成包含体 a. 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b. 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c. 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞 受伤害 2. 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。 3. 表达的质粒载体构建比较简单。 * * 目的基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 基因克隆的技术路线 大肠杆菌表达体系 大肠杆菌表达体系优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。 大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。 大肠杆菌表达载体 启动子 核糖体结合位点 转录终止子 3.2 有功能的启动子的分离 一般程序： 1. 选用一种适当的核酸内切酶，