极性C18-亲水作用色谱-强极性化合物分离重点专题.pptVIP

* * * * Alpert〔2〕认为，溶质在流动相和固定相表面水层中存在分配作用，溶质的保留是通过在固定相表面水层与流动相中的分配作用实现的。而吸附理论则认为保留是基于溶质在固定相上的吸附作用，随着流动相中有机溶剂比例的改变以及固定相的不同，还存在离子交换作用、偶极作用等。 * 中药成分复杂，其成分和治病机理还有待进一步研究，对中药的质量控制仍然缺乏全面合理的评价方法，因此限制了中药在世界范围的推广和应用。目前世界公认的中药质量控制方法是指纹图谱法，其中应用最广泛的是基于反相色谱柱而建立的高效液相色谱指纹图谱法。反相色谱法主要针对中药中的中等极性或弱极性成分的分离分析〔。中药传统的用药方式是水煎法，水溶液中存在大量的极性成分，如多糖、有机酸、强极性糖苷等，这些成分在反相色谱上几乎没有保留，所以无法用反相色谱法将其良好地分离并获取他们的信息。但是，这些强极性成分有可能是中药的活性成分或具有某些活性，具有研究的价值，因此非常有必要采用适当的方法对中药的强极性成分进行分离和分析。正相色谱法是目前用于分析中药极性成分的常用方法，但是正相色谱法存在诸多局限: 流动相均为有机溶剂，对水溶性溶质的溶解性能较差; 流动相组成较复杂; 流动相与质谱检测器不兼容等。与正相色谱法相比，亲水作用色谱具有诸多优势: ( 1) 流动相组成简单; ( 2) 对极性溶质溶解性能好; ( 3) 与质谱检测器兼容。同时，亲水作用色谱与反相液相色谱的流动相溶剂组成相似，但作用机理不同，可以实，可以实现复杂中药成分分离的互补，使极性成分和中等及 弱极性成分均可得到有效分离，使中药成分分析更加全面。 A、B 氨基 C、D 氰基 E 氨基甲酰 F 聚氨基甲酰 G α-环糊精 不同固定相包含极性大小不同的官能团,表现出对化合物不同的选择性和分离能力 有机溶剂的种类和浓度同样会对色谱的分离效果产生重要影响，乙腈是亲水色谱中最常用的有机溶剂 乙腈浓度需要于60%，随着乙腈浓度的降低，保留时间下降 亲水作用色谱中常用的挥发性缓冲盐包括甲酸铵、乙酸铵及碳酸氢铵，缓冲盐的种类和浓度均会对色谱分离效果、重现性以及联用的质谱产生重要影响 流动相的pH值会影响溶质的电离从而影响色谱分离，同时，pH的变化还会对色谱固定相如硅醇基、氨丙基的性质产生影响 通常情况下，亲水模式分离中，溶质在固定相上的保留是一个放热的过程，所以增加柱温会导致保留时间降低 亲水作用色谱在分离极性化合物方面表现出的优势，使其得到了广泛的应用 亲水作用色谱用于同时定量检测人血浆中的叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸 糖类化合物具有强极性的特点，是亲水作用色谱研究的对象之一，这篇文献就报道分别使用氰基、氨基键合固定相分离单糖、二糖及寡糖。 蛋白组学中，亲水作用色谱可作为磷酸化肽、糖肽的有效分析工具，亲水作用色谱与质谱联用实现了GPI的富集、分离检测 根据不同亲水色谱固定相表现出的正交性，二维亲水作用色谱可实现复杂样品的分离分析 强极性小分子分析解决方案 样品2 样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物 XAqua C18 乙腈甲酸水 主峰纯度96.55% S-Click XIon乙腈甲酸水 主峰纯度84.91% 分离度差 保留适中分离度良好 强极性小分子分析解决方案 样品3 样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物 XAqua C18 100%甲酸水 主峰纯度96.55% XCharge C18 100%甲酸水 主峰纯度96.55% 分离度差 保留弱 分离度差 保留适中 分离度良好 * 亲水作用色谱与中药中强极性化合物的分离 专题讲座 主要内容 亲水作用色谱保留机理及特点 亲水作用色谱影响因素及应用 中药中强极性化合物的分离 研究方向 强极性化合物的分离 反相色谱 正相色谱 溶解度 与质谱联用 ？ A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177. 亲水作用色谱 HILIC 亲水作用色谱机理及特点 亲水作用色谱 亲水作用色谱法的分离原理与正相色谱法相近的极性固定相、以高比例极性有机溶剂和低比例水的混合溶液为流动相，主要用于极性化合物的分离。被分析物质在色谱柱中的保留和其自身的极性成正比，和流动相的极性成反比。被分析物质的极性越强，在色谱柱中保留越强。增加流动相中水的比例，使流动相极性增强，则分析物保留减弱。 亲水色谱固定相 ( 1) 传统的正相色谱固定相，包括纯硅胶固定相、氨基键合相、二醇基键合相、氰基固定相。该类固定相对糖、有机酸、核苷等强极性化合物表现出良好的分离选择性; ( 2) 离子交换固定相，该类固定相具有很好的亲水性，表面带有较强的表面电荷，用于亲水作用色谱时表现为一种离子交换( 或排斥) /亲水作用混合色谱模式; ( 3) 专