山羊BMSCs的体外分离培养和生物学特性的研究及腺病毒扩增的实验研究-外科学（脊柱外科）专业论文.docxVIP

广州医学院 2009 级 硕 士学位 论 文 山羊 BMSCs 的体外分离培养和生物学特性 的研究及腺病毒扩增的实验研究 Experimental study of isolation ,culture and characteristics of goat BMSCs in vitro and amplification of adenovirus 研 究 生：吴海峰 学科专业：外科学（脊柱外科） 导 师：郭奇峰 教授（主任医师） 所在单位：广州医学院附属广州市第一人民医院骨科 资助基金项目：广东省科技计划项目“基因修饰的 BMSC+CPC 治疗骨质疏松性椎体压 缩骨折的实验研究” 关 键 词：骨组织工程；山羊；骨髓间充质干细胞；体外培养；鉴定；腺病毒； 扩增 2012 年 4 月·广州 广州 广州医学院硕士学位论文 2 2 目 录 缩略语表 1 中文摘要 2 英文摘要 7 前 言 13 第一部分 山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定及体外向成骨细胞、成脂细胞 的诱导分化15 1 材料 15 2 方法 18 3 结果 24 4 讨论 31 5 附图 35 第二部分 Ad-BMP-2-bFGF-GFP 腺病毒的扩增、纯化及滴度测定 37 1 材料37 2 方法38 3 结果41 4 讨论44 参考文献 48 综 述 56 致 谢 64 学位论文原创性声明 65 学位论文知识产权权属声明 65 1 1 缩 略 语 表 缩略语 ALP 英文全称 Alkaline phosphatse 中文全称 碱性磷酸酶 BMSCs BSA DMEM DMSO ECM FACS FBS GFP Bone marrow mesenchymal stem cell Bovine serum albumin Dulbecos modifild eagle medium Dimethyl sulfoxige Extracelluar matrixc Flow cytometry Fetal bovine serum Green fluorescent protein 骨髓间充质干细胞 牛血清白蛋白 DMEM 培养基 二甲基亚砜 细胞外基质 流式细胞仪 胎牛血清 绿色荧光蛋白 CCK-8 Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂盒 OD Optical density 光密度 PBS Phosphate-buffered 磷酸盐缓冲液 rpm Revolutions per minute 每分钟转速 Ad adenovirus 腺病毒 BMP-2 Bone morphogenetic protein-2 骨形态发生蛋白-2 bFGF basic fibroblast growth factor 碱性成纤维细胞生长因子 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 二乙胺四乙酸 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 CPE cytopathic effect 细胞病变效应 2 2 山羊 BMSCs 的体外分离培养和生物学特性的 研究及腺病毒扩增的实验研究 硕士研究生：吴海峰 导 师：郭奇峰 教授（主任医师） 广州医学院附属广州市第一人民医院骨科，广州 510180 中文摘要 背景 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenehyma1Stem Cells，BMSCs)是源自动物 胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞，主要存在于全身的结缔组织与器官间质中， 以其在骨髓中的含量最多。骨髓间充质干细胞具有自我更新的能力以及多向分化、 增殖的潜能。骨髓间充质干细胞因为具有可于自体获得、易培养、移植后能够长期 存活并且不会出现排斥反应，可被外源基因转染并长期表达的优点，近年来成为基 因治疗的研究热点，在多学科多领域做为一种理想的种子细胞得到了广泛应用。但 是骨髓间充质干细胞虽然在体内的来源比较广泛，但是骨髓间充质干细胞在骨髓中 含量非常少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，并且随着身体机能的下降与个体的 衰老，数量会逐渐减少。而基因治疗开展的首要条件是种子细胞的获取和培养传代， 如何能够在体外获得足够数量和较高纯度的种子细胞极其重要。 另外，腺病毒是目前应用最广的能高效将目的基因导入细胞的媒介之一，它是 一种非致病性复制缺陷型载体，能提供长期的基因表达能力且免疫源性非常低；其 宿主范围广，可感染人、鼠、山羊等多种属，具有广泛的组织亲和性；感染宿主后 以附加体形式存在，其基因并不整合到宿主细胞基因中，无插入突变激活癌基因的 危险，且外源基因能游离地表达，持续表达数周或数月后消失，避免了目的基因持 续过度表达引起相应的副作用。 本