拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者中新发现的HBV逆转录酶rtM204Q变异株的病毒学特点研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE IV 目 录 中文摘要……………………………………………………………… 1 ABSTRACT ………………………………………………………… 6 符号说明 ………………………………………………………………12 前言 ……………………………………………………………………14 1 材料与方法 …………………………………………………………16 1.1 研究对象……………………………………………………………16 1.2 主要试剂……………………………………………………………16 1.3 主要仪器……………………………………………………………17 1.4 HBV DNA 提取 …………………………………………………17 1.5 HBV RT 全基因组巢式 PCR 扩增方法……………………………18 1.6 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果…………………………… 20 1.7 HBV DNA 的克隆、鉴定及测序分析…………………………… 20 1.8 定点突变改建 pTriEx-1.1 倍 HBV 重组质粒 ……………………24 1.9 五种变异克隆株上 RT 区与改建成功的 pTriEx-1.1-HBV（C）上 的 RT 区置换克隆及鉴定………………………………………………28 1.10 重组质粒转染 HepG2 细胞及加药培养 ……………………… 30 1.11 变异病毒株的复制力测定及对药物敏感性实验 …………… 30 2 结果 ………………………………………………………………31 2.1 PCR 扩增目的样品 L107 HBV RT 区,TA 克隆及其基因型分析…31 2.2 改建的 pTriEX-HBV(C)-1.1 载体酶切鉴定与测序鉴定…………35 2.3 HBV 突变型与野生型的 RT 区与 pTriEX-HBV-1.1 倍载体上的 RT 进行置换 …………………………………………………………… 36 2.4 变异病毒复制力水平与表型耐药特点的鉴定 ………………37 3 讨论 ………………………………………………………………40 4 结论 ………………………………………………………………45 参考文献 …………………………………………………………… 46 综述 ………………………………………………………………… 51 攻读学位期间发表的学术论文目录 ………………………………61 致谢 …………………………………………………………………62 PAGE PAGE 10 拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者中新发现的 HBV 逆转录酶 rtM204Q 变异株的病毒学特点研究 中 文 摘 要 我国有 9300 万慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV) 感染 人群，慢性 HBV 感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细 胞癌，我国每年死于 HBV 感染相关疾病的患者约 35 万人。抗 HBV 治疗是慢性乙型肝炎治疗及阻断其向肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌发展 的重要手段，核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogs，NAs）是抗 HBV 治疗的主要药物，但随用药时间的延长，病毒的耐药问题已成 为临床抗 HBV 治疗的棘手问题。1998 年上市的拉米夫定（lamviudine， LAM）在我国有长达 13 年的临床抗 HBV 治疗史，超过 120 万慢性 乙型肝炎患者曾经应用 LAM 进行抗病毒治疗，由于该药服用方便、 安全，治疗费用相对低等优点，目前仍有大量患者在服用该药。 HBV 多聚酶缺乏校对活性，因此在病毒复制过程中容易产生错 配，产生大量序列多样性的病毒株，形成病毒准种。在药物选择压力 下，对药物适应性强的病毒变异株可演变为优势株，引起病毒耐药。 NAs 的作用靶位在 HBV 多聚酶的逆转录酶（reverse transcriptase, RT） 区，抑制病毒的复制。引起病毒耐药的基因变异分为原发耐药变异 （primary resistance mutation）和补偿变异（compensatory mutation）： 前者直接引起病毒对药物敏感性的下降，主要是 rtM204V 和 rtM204I， 又被称为 YMDD 基序的 YVDD 和 YIDD 变异；后者补偿出现原发 耐药变异病毒株下降的病毒复制力，主要是 rtV173L 和 rtL180M（常 于 rtM204V 联合出现）, rtL80I（常于 rtM204I 联合出现）。HBV 对 LAM 的耐药发生率高，单独用 LAM 治疗 1~4 年病毒耐药变异发生 率分别为 17％、40％、55％和 67％。 随着用药时间的延长，用药人群的不断扩大，以及在许多病例中 的不合理