对卡门氏单位的科学套用.pptVIP

血清ALT活性的测定 生物化学与分子生物学教研室 【实验目的】 1．掌握血清ALT活性测定的基本原理。 2．了解血清ALT的测定方法(赖氏法)及临床意义。 【实验原理】 丙氨酸氨基转移酶(ALT)，又称谷丙转氨酶(GPT)， 在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。 一是金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。 ALT活性测定主要有两类方法： 二是卡门氏（Karman）法，其原理如下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。 【方法评价 】 丙酮酸+NADH+H+ 乳酸+NAD+ LDH 【试剂】 1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)：将420mlNa2HPO4溶液和80ml0.1mo1/LNaH2PO4溶液混匀，置冰箱保存。 2．基质溶液(DL-丙氨酸200mmol/L，α—酮戊二酸2mmo1/L)：精确称取DL-丙氨酸1.79g和α—酮戊二29.2mg，溶于50ml0.1mo1/L磷酸盐缓冲液中，用1mol/LNaOH溶液（约0.5ml）调至pH至7.4，再加磷酸缓冲液至100ml,最后加入麝香草酚（每L可加0.9g）防腐，置冰箱中保存，可用一个月。 3．2.4—二硝基苯肼溶液(1mmol/L)：称取2.4—二硝基苯肼19.8mg,溶100ml/L盐酸中，置室温保存。???????????? 4．0.4mol/L氢氧化钠溶液：NaOH16g溶于蒸馏水中调至1000ml。????????? 5．丙酮酸标准液(2mol/L)：丙酮酸钠22.0mg，置于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。 6. 0.1mol/LNa2HPO4溶液：称取Na2HPO4·2H2O17.6g溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，至冰箱中保存。 7. 0.1mol/LKH2PO4溶液：称取KH2PO413.6g溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，至冰箱中保存。 【器材】 恒温水浴锅，723型分光光度计，刻度吸量管，滴管，试管等。 【试剂与器材】 【步骤】 加入物(ml) 管号 0 1 2 3 4 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2mmol/L丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质溶液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 相当于酶活力单位 0 28 57 97 150 （2）分别向各管加入2，4二硝基苯肼液0.5ml,混匀后置37℃ 水浴箱，20分钟后取出，分别向各管加入0.4mol/LNaOH溶液5.0ml。 （3）混匀，放置10分钟在505nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管光密度。各管光密度值分别减去0号光密度，以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准曲线。 （4）当血清标本的酶活力单位超过150时，应将血清用生理盐水稀释5倍或10倍后再进行测定。 （5）加入2，4二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。 （6）绘制标准曲线：第1-4管的光密度值值分别减去0管光密度值值，所得差值为纵坐标；对应的卡门氏单位为横坐标，作图，画出标准曲线。（标准曲线已绘） 1．标准曲线的制作： (1)取5支试管，编号，按下表操作： 加入物（ml） 测定管 对照管 血清 0.1 0.1 基质溶液 0.5 — 混匀，置水浴箱中保温30分钟 2,4-二硝基苯肼液 0.5 0.5 基质溶液 — 0.5 混匀，置水