微量凯氏定氮实验报告.doc

山东大学实验报告 2013年 6月 2日 科目 生化实验 题目 微量凯氏定氮 仪器编号55 实验目的 1.掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法 2.学会使用凯氏定氮仪并学会用凯氏定氮仪测出小油馕中的蛋白质含量 实验原理 凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3 （1） 2NH3 +H2SO4 = (NH4)2SO4 （2） (NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3 （3） 反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行。 蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以 系数6.25，即为蛋白质含量。 实验用品 器材 1. 凯氏定氮仪 2. 电炉 3. 消化架 4. 锥形瓶100ml（×5） 5. 量筒10ml(×1) 6. 滴定管（5ml，可读至0.02ml） 7. 凯氏烧瓶（×2） 8. 玻璃珠 9. 吸耳球 10．移液管（2ml，5ml，10ml×1） 试剂 1. 浓硫酸（A.R.） 2. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾3份与硫酸铜1份混合研磨成粉末。 3. 40%氢氧化钠溶液：30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。 4. 2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml。 5. 混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:1混合。 6. 0.0093mol/L标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释标定。 实验步骤 1．样品的消化(共同做的) 将六个50mL的凯氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近）1-3(空白),4-6(实验)，1-3号烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。4-6号烧瓶内加入1.0mL样液。然后用取样器各加浓硫酸4mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约200mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到凯氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，注意先启动抽风机在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化时间为2～3h，冷却，准备蒸馏。在消化时可以同时进行第二步。 2．定氮仪的洗涤 仪器应先经一般洗涤，再经水 蒸气洗涤。 蒸气发生器中装加有H2SO4的蒸馏水和数粒沸石，加甲基橙指示剂后显粉红色。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受锥形瓶瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏3分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。若硼酸的颜色变为淡绿色，说明定氮仪内有残留氨，需要进一步用蒸汽洗涤。若反应室内有上次操作剩余的残夜，可以通过图中5向反应式加冷的蒸馏水，然后短时间关闭C，则残夜会倒吸回贮液管，重复几次，并用蒸汽洗涤几分钟，再用上述方法检验是否已经洗干净。打开B废液排出管的夹子可以将废液放出。 3．标准品练习（标准硫酸铵溶液，含氮量0.3mg/ml） 仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。打开A，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml硫酸铵溶液，关闭A，向5中加入10ml30%