马传染性贫血病毒分离株WH17的全基因组克隆、序列分析及LTR 启动子活性研究.pptVIP

马传染性贫血病毒分离株WH17的全基因组克隆、序列分析及LTR 启动子活性研究 主要内容 研究背景 目的和意义 技术路线 结果与讨论 结论 LTR（长末端重复序列）在EIAV中的功能 启动子功能，其中含有病毒转录调控的顺式作用位点 LTR在病毒调节蛋白和细胞因子的共同作用下，调控对病毒蛋白的表达 LTR序列的改变可能会引起病毒转录和复制方式的改变，进而引起其细胞嗜性和致病性的改变 gp90（表面蛋白）N连接糖基化在EIAV中的功能 改变慢病毒的细胞嗜性 影响病毒的毒力 病毒逃避机体免疫系统 第一部分 马传染性贫血病毒分离株WH17的全基因组克隆和序列分析 结果与讨论 EIAV分离株WH17的电镜照片 EIAV分离株WH17全基因组克隆 　 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 重组质粒的酶切鉴定 分离株WH17与国内外毒株核苷酸序列的差异率 本次实验分离的EIAV毒株WH17前病毒基因组全长8268bp,与EIAV-L株、DA株、DLA株序列同源率分别为86.0％、85.8％和85.2％。 在确定了EIAV分离株WH17核苷酸序列的基础上，序列分析发现了一些新的结构和功能区的变异，下面分别进行比较和讨论。 EIAV分离株WH17的LTR与L株、DA株在U3区的基序没有差别，但在U3与U5结合处的TAR前比L株和DA株多一个E-box。 WH17…CTTGCATTCTGACATTTGGA… L…CTTGTATTCTGACATTTGGA… DA…CTTGTATTCTGACATTTGGA… EIAV分离株WH17的gp90与国内外各毒株相比变异较大，氨基酸序列的同源率均只有60％多, 但仍可以鉴定出四个保守区和六个保守的糖基化位点。 第二部分 目的和意义 对EIAV分离株WH17 的LTR序列分析表明：其LTR在U3和U5结合处比DLA25、DLA118代次毒分别多一个和两个E-box。由于TAR能与转录因子Tat结合促进转录作用，增强病毒的复制，因此，此处的E-box能否近距离起到促进转录作用还不能确定。 E-box基序是转录调节因子bHLH家族成员，bHLH是个体发育过程中重要的转录调节因子，也是与造血过程有关的转录调节因子。  1 2 3 4 5 重组质粒的鉴定 突变分子克隆的获得 pCDNA3.1- Tat的间接免疫荧光检测 CAT ELISA 检测结果  在有Tat 蛋白存在情况下, pWH17、 pWH17N191 pDLA-25及pDLA-118的LTR 起始活性都得到了提高, Tat蛋白可以特异性地增强驴白细胞弱毒株源LTR的启动子活性。 本次实验的结果显示EIAV分离株WH17的LTR 的E-box基序的促进转录作用并没有体现。 本实验在FDD细胞中没有检测到CAT活性 ，可能的原因有： 　 　连入CAT质粒的LTR都是白细胞源性，可能对FDD细胞没有嗜性。 　 　CAT ELISA检测试剂盒的灵敏度不是很高。 结论 本次实验对EIAV分离株WH17全基因组序列克隆,并测定其核苷酸序列。 鉴定出EIAV国内外各毒株gp90四个保守区及六个保守糖基化位点。 对LTR启动子活性研究表明：伴随着EIAV毒力的逐步减弱，EIAV强毒株逐步适应驴白细胞，病毒LTR的启动能力逐渐增强。 经过E-box的点突变（C→T）缺失证明EIAV分离株WH17的LTR 的E-box基序没有起到促进转录作用。 从本次实验在FDD细胞中没有检测到CAT活性 可以初步得出 LTR可能是决定细胞嗜性的影响因素之一。 致谢 值此论文完稿之际，首先向导师童光志研究员和陈焕春教授致以深深的敬意和衷心的感谢。感谢两位导师对我在学业中的辛勤培养和生活上的关怀，他们渊博的学识、严谨的治学态度、一丝不苟的敬业精神、实事求是的工作作风、开拓创新的理念，使我受益匪浅，将铭记终身。 感谢马传贫课题组周涛博士、全滟平博士、左咏梅硕士、侯绍华博士、刘益民硕士及试验室其他同学在实验和生活方面给予我热心帮助和亲切关怀！ 感谢华中农业大学病毒室的老师和同学们在学习和生活上对我的关心和帮助。 本研究资助项目 　　　　　 CAT酶标准曲线 OD vaule （405nm） CAT Vaule(ng/ml) Tat对不同LTR启动子活性的作用 pWH17LTR 0.055 0.209 3.8 pDLA-