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中文摘要………………………………………I
第一章引言……………………………………．1
第一节研究背景简介…．．…………………………1
1．1．1结构蛋白组学…．．…………………………………．．1
1．1．2蛋白质制备的真核表达系统方法…．…．．．．…．………．．…．．2
1．1．3昆虫杆状病毒表达………………．………………．．．．．4
1．1．4
Sf9昆虫细胞的生物学特性…．．．……．．…．……………．．9
1．1．5原核表达系统中的高效表达方法一POET法………………．．10
第二节研究目标、内容和创新性……………………．12
1．2．1研究目标……．………………．．．…………………12
1．2．2研究内容…．………………．……………．………．13
1．2．3课题的创新性………………．…………………．…．14
第二章材料与方法．……………………………．．18
第一节实验材料…．……．………………………．．19
2．1．1Sf9细胞株和杆状病毒来源…………………………．…19
2．1．2主要试剂……………．．………………．…………．20
2．1．3使用的试剂盒…………．…………………………．．20
2．1．4主要缓冲液及试剂的配置………．………………．……20
2．1．5实验仪器．．……………………．…………………23
2．1．6．运用软件………………………………．．……．…．25
III
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第二节实验方法…………………………………25
2．2．1Sf9细胞的复苏扩增及其冻存…．．．．…………………．…25
2．2．2杆状病毒…………．．………………．．…．………．．25
2．2．4转染昆虫细胞和病毒的分离……………………．．……．27
2．2．5收集感染后的细胞并用蛋白印迹检测表达的融合蛋白…．……．28
2．2．6肽指纹质谱鉴定表达酶解后蛋白样品制作…………．．……．29
2．2．7规模培养可溶表达的目的蛋白…．．…………．．…………30
2．2．8纯化目的蛋白………．…………．…．………．．……．30
2．2．9BCA法测蛋白浓度……．………………．…………．．．33
第三章实验结果与分析…………………．………．36
第一节细胞转染结果背景简介………………………36
第二节蛋白印迹检测表达融合的蛋白………………．．．．38
第三节质谱鉴定表达的蛋白结果背景简介．……………．．39
第四节阴阳对照中的蛋白表达情况背景简介……………．42
第五节分别大规模转染细胞表达纯化蛋白背景简介………．．43
第六节MapKl4蛋白的酶活检测曲线背景简介……………44
第四章实验结果讨论……………………………46
第一节改进POET方法…………………………．．46
第二节质谱结果讨论……………………………47
IV
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第三节蛋白表达、亲和层析及酶活测定………………．．47
4．3．1蛋白表达及纯化过程…．…．…………．……………．．．47
4．3．2纯化出的蛋白酶活检测．．…………．…．……………．．．48
第五章实验结论………………………………．．49
参考文献………………………………………51
致谢…………………………………．………56
个人简历………………………………………57
V
符号说明
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Sf9Cell
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