原位杂交原理.ppt

现代生物学实验技术 实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组 合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上进行第二 向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白质的等电点 不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )；第二项 则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把复杂蛋白质混 合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和质量两次分离 后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。 IEF/SDS双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在 1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。 采用IEF/SDS分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS所 用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS所用的为 板状。IEF/SDS与IEF和SDS的区别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第 一向IEF时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与 SDS结合以利于第二向SDS的进一步分离，必须在第一 向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP- 40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含 有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋 白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的 二硫键，促使