硫化氢对砷致大鼠海马神经细胞氧化损伤的影响-神经病学专业论文.docxVIP

有抗氧化损伤的作用[14]。然而，长久以来，人们对于硫化氢的认识仅限于它的毒 性作用。直到上个世纪 90 年代中期 Abe[15]等首次证实，硫化氢是一种新型的重 要的内源性神经调质，是继一氧化碳（carbon monoxide，CO）和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后被发现的第三种气体信号分子[16]，在体内多个系统中广泛存在。 在哺乳动物体内，胱硫醚-β-合酶(cystathionine-beta-synthase,CBS)和胱硫 醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)是生成内源性硫化氢有关的两个 主要的酶[17,18]，其中胱硫醚-β-合酶（CBS）是大脑中合成硫化氢的主要酶，主 要分布在海马、小脑、皮层和脑干等部位[17,19-21]。用硫化氢的供体硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）预处理创伤性脑损伤的小鼠，可减轻创伤性脑损伤诱导的 神经损伤，表明硫化氢可能有拮抗神经元损伤的潜力[22]。体内含硫氨基酸代谢产 生的硫化氢对神经系统，特别是海马的功能具有调节作用[23-25]，从而开启了人们 对硫化氢生理作用认识的新视角。 针对硫化氢是体内生理性调节神经传导的气体递质，对细胞又具有抗氧化损 伤的作用[14]，而砷对细胞的直接毒性机制主要是通过氧化损伤发挥作用，因此本 研究以砷中毒的大鼠海马神经细胞为模型，探讨硫化氢对砷致大鼠海马神经细胞 氧化损伤的影响，了解硫化氢对砷中毒神经细胞的神经保护作用及机制，为砷的 神经毒性提供预防和治疗的实验依据。 1.材料与方法 1.1 实验动物 新生 Wistar 大鼠（24h）,由贵阳医学院实验动物中心提供,批号 ISCXK（黔） 2012-001。 1.2 主要试剂和仪器 主要试剂 Hyclone DMEM/F12 1：1 细胞培养液、L-多聚赖氨酸、胎牛血清，阿糖胞 苷（5）、双抗、硫氢化钠、亚砷酸钠、微量丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧 化酶（SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GHS-PX）测试盒、过氧化氢酶（CAT） 测试盒，、乙酰胆碱酯酶（T-CHE）测试盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解 液（50ml），、大鼠胱硫醚-β-合酶（CBS）ELISA 试剂盒。 主要仪器 CO2 培养孵箱、超净台、倒置相差显微镜、台式离心机、恒温水浴箱、酶标 仪、移液器、台式高速冷冻离心机、手提式压力蒸汽灭菌器、实验专用超纯水机。 1.3 方法 1.3.1 L-多聚赖氨酸预处理培养皿 在超净台下，将无菌条件下配置并分装（1.5ml/离心管）储存于-20℃的 0.1mg/ml 的 L-多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL），置于超净台的室温下溶解， 将溶解后的 PLL 和 12ml 无菌超纯水置于 15ml 无菌离心管中混匀，即为 0.0125mg/ml 终浓度的 PLL。按 24 孔培养板和 10cm 的培养皿培养细胞的容积（分 别为 500ul 和 5ml）加入相应体积的 0.0125mg/mlPLL，盖上上述培养孔盖和培养 皿盖，超净台下静置 15min 包被，弃去各培养孔和培养皿内的 PLL。无菌超纯水 将 PLL 包被的培养孔和培养皿洗 1 遍，再用无菌 PBS 洗 2 遍。盖上上述培养孔盖 和培养皿盖置于 37℃、5% CO2 培养孵箱中过夜，待接种培养细胞时用。 1.3.2 体外培养原代大鼠海马神经细胞 参照[7]原代海马神经细胞培养方法，在严格的无菌条件下，将新生的Wistar 大鼠（＜24h）反复皮肤消毒3次后，并在75%酒精浸浴5min，将新生的Wistar大 鼠断头，头颅用4℃的D-Hank’s平衡液冲洗2次，弃去洗液。在4℃的DMEM/F12 的细胞培养液中用眼科镊和眼科剪逐层剥离头皮软组织、颅骨及脑膜，暴露出脑 组织，取出全脑，置于一备有4℃DMEM/F12细胞培养液的培养皿中，分离出双侧 海马组织，移入另一装有4℃DMEM/F12细胞培养液的培养皿中，去除脑膜及血管， 将海马组织碎块移入5ml已加入适量4℃DMEM/F12细胞培养液的无菌试管中，用眼 科剪剪碎海马组织碎块至约1mm3大小，用1ml移液枪头轻轻吹打成细胞悬液（勿 吹出气泡），200目的细胞筛过滤后，收集滤液1000转/分离心2次，每次离心5min， 弃上清，收集细胞并加入适量的4℃DMEM/F12细胞培养液，1ml移液枪头轻轻重悬 细胞，在倒置相差显微镜下用细胞计数板计数后，根据计数的结果，用细胞全培 养液（10%胎牛血清，1%双抗）将细胞密度调整至(1-2)×108个/ml，分别种植在 预先铺有0.0125mg/ml多聚赖氨酸的24孔培养板及10cm的培养皿中，将上述细胞 培养皿置于37℃、5% CO2培养孵箱