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第五章 分子荧光分析法 2.激发态→基态的能量传递途径 非辐射能量传递过程 非辐射能量传递过程 辐射能量传递过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 2.荧光光谱(或磷光光谱) 3. 荧光光谱的特征 镜像规则的解释 三、荧光的产生与分子结构的关系 2.化合物的结构与荧光 2.化合物的结构与荧光 四、荧光强度与荧光物质浓度的关系 五、影响荧光强度的因素 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b) 5. 荧光熄灭 930型荧光计光路示意图 荧光分析仪器的主要部件 二、荧光分析仪器的类型 荧光分光光度计 荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 第三节 定性和定量分析 第四节 荧光分析新技术 荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 荧光试剂 邻苯二甲醛(OPA) 2.无机化合物的荧光分析 [课后练习] 一. 主要组成及部件的功能 荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图 光源 氙灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理 仪器控制 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 发射单色器 问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？ 激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） 样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 检测器：紫外-可见（光电倍增管） 显示系统：指针式、数字式及计算机显示 1.荧光光度计 2.荧光分光光度计 荧光分光光度计结构示意图 分光系统：光栅 用途：测定激发光谱、荧光光谱及定量分析。 最大激发波长?exmax和最大荧光波长?emmax是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的条件。 激发单色器 发射单色器 吸收池 仪器 校正 光源 光路 荧光分光光度计 紫外-可见分光光度计 入射光与吸收光同方向 入射光与荧光垂直方向 两种光源(紫外+可见) 一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%) 空白溶液(T=100%) 紫外无吸收 两面透光 低荧光材料 四面透光 紫外-可见分光光度计: 光源 样品池 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 荧光(磷光)分光光度计: 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 荧光分光光度计 样品池 I0 It I0 It IF,p 定量依据：F=Kc 定性依据荧光光谱和激发光谱 一、定性分析 二、定量分析 1. 标准曲线法 直接荧光标准曲线法 F Cs Fx Cx 2.直接比较法 激光荧光分析 时间分辨荧光分析 一、荧光新技术 三维荧光分析 核酸分子荧光探针 薄层扫描法中的荧光扫描法 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物 有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环；维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) 中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类） 荧光胺 荧光条件： ?ex=275、390nm， ?em=480nm 适用：脂肪族和芳香族伯胺 适用：伯胺类、?-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸） 荧光条件： ?ex=340nm， ?em=455nm (2-巯基乙醇存在，pH9~10的缓冲溶液) 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物 研究对象 阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr 阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光配合物的荧光减弱甚至熄灭 * 1.分子荧光分析分析法的基本原理（了解） 3.影响荧光强度的因素（熟悉） 2.分子荧光分析仪器的结构及类型及新技术（了解） 4.分子荧光分析法的基本概念、荧光光谱、 激发光谱、定量分析的依据（掌握） 发光分析法：物质吸收一定能量后跃迁到激发态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基态的现象所建立的分析方法。 光致发光：?以光能激发而产生的发光 荧光和磷光? 光照、加热、化学反应、生物代谢等 荧光分析法：利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进行定性和定量分析的方法。 定性鉴别：?由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同。 定量分析：如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同。 1. 根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光 2. 根据激发光的波长范围分类： 紫外-可见荧光、红外荧光、X射线荧光 荧光分析法分类