植物凝集素的分离纯化及部分性质测定.doc

第11周 2011-5-3/4 植物凝集素的分离纯化及部分性质测定 分离纯化工艺策略： 主要是根据物质的结构和性质来选用各种纯化技术。工艺次序的选择策略包括： 1.应选择不同机理的分离单元组成一套工艺； 2.应将含量多的杂质先分离出去； 3.尽早采用高效分离手段； 4.将最昂贵、最费时间的分离单元放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段主要目的是尽量缩小样本体积，提高目的物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）； 5.随后是高分辩率的操作单元，如具有选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以使分离效益大大提高。色谱分离的次序。一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤之间的过渡。 如： ◇在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的交换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强。 ◇凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。 总之，蛋白质的纯化大至步骤为：样品经初步提取筛除部分杂质后，选择不同的层析手段相互配合进一步提纯。 第一部分 离子交换层析 1. 原理： 离子交换层析（Ion-exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对各类化学物质或生物大分子因电荷差异而产生不同的结合力，从而将混合物中不同组分进行分离的层析技术。 Cation exchanger（阳离子交换）: 层析介质本身带负电荷,交换带正电荷物质 Anion exchanger （阴离子交换）:层析介质本身带正电荷,交换带负电荷物质 当缓冲环境 pH pI, 蛋白质带负电 当 pH pI, 蛋白质带正电 当pH = pI, 蛋白质不带电 以阳离子交换树脂交换分离蛋白质的原理和方法为例: 将阳离子交换树脂（本身带负电荷）颗粒填充在层析管内，带正电荷的蛋白质(pHpI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含阳离子（如Na+)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Na+浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。 2.实验室常用介质： 离子交换介质：适用于分离蛋白质等生物大分子与水的亲和力较大，载体孔径大 弱阳离子交换剂 弱阴离子交换剂 CM-Cellulose DEAE-Cellulose  羧甲基-纤维素 二乙基氨基乙基-纤维素 CM-Sephadex DEAE--Sephadex  羧甲基- 葡聚糖凝胶 二乙基氨基乙基- 葡聚糖凝胶 CM-Sepharose DEAE-Sepharose  羧甲基- 琼脂糖凝胶 二乙基氨基乙基- 琼脂糖凝胶 CM-Sepharose 和 DEAE-Sepharose由于性价比最高，因此作为实验室最常用的离子交换树脂 3.实验操作： 在这一部分中，本实验分别选用CM-Sepharose阳离子柱 和 DEAE-Sepharose阴离子柱 对学生的生物化学知识实践能力进行考查及训练。待纯化样品已经过初步提纯，具体操作步骤如下： （1）用缓冲液平衡，经过至少5-6个柱体积的缓冲液平衡，使整个层析体系（包括层析柱里的凝胶和各仪器之间连接的管道）达到目标pH和离子强度，为下一步上样做准备。CM-Sepharose阳离子柱使用pH5.0,20mM的NaAc-HAc缓冲液；DEAE- Sepharose阴离子柱使用pH9.0,50mM的Tris-HCl缓冲液 （2）蛋白粗提液上样，缓冲液平衡后，使之前用缓冲液透析过（pH和离子强度和缓冲液相同）的蛋白样品通过层析柱；根据前面所述的层析介质结合原理，在这一过程中在pH9.0条件下带负电荷（蛋白PI9.0）的蛋白结合在阴离子交换树脂上；在pH5.0条件下带正电荷（PI5.0）的蛋白则结合在阳离子交换树脂上。为满足上述条件的蛋白随缓冲液流出层析柱。 （3）洗脱，选择适当盐（NaCl）浓度的缓冲液上柱，由于Na+或H-可以蛋白竞争性的结合在阳离子或阴离子交换树脂上，从而使之前结合在树脂上的带电蛋白质脱离下来。盐离子浓度越高这种效应就越明显，因此随盐离子浓度的变化收集不同时期的洗脱蛋白，从而达