PBMCs的分离和计数.ppt

PBMCs的分离和计数 实验目的和要求 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 掌握细胞计数的方法 实验原理 外周血中细胞种类 细胞密度 红细胞和多核白细胞 1.092-1.093 PBMC(淋巴细胞和单核细胞) 1.074 淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077 密度梯度离心法：利用一种密度介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种细胞加以分离。 实验方案 抽取外周血 分离PBMCs 细胞计数 实验材料 1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板 实验步骤 肝素抗凝静脉血1-1.5 ml 加等体积的Hank’s液稀释 置于2ml淋巴细胞分离液上 (交界液面：一定不要打乱) 稀释后的抗凝血 淋巴细胞分离液 用Hank′s液洗、离心 (1500 rpm，5min) 重复2次 血浆 分层液 红细胞粒细胞 离心（2000rpm，25min） PBMCs层 细胞计数板  细胞计数 数上不数下，数左不数右。 用100ulHank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液+40ul Hanks液+50ul台盼兰, 混匀 取10ul于细胞计数板上 进行细胞计数 细胞计数 实验结果计算 2 2个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/ml) ×104×稀释倍数 = 活细胞百分率 = 活细胞数 细胞总数 × 100% 细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞不着色） 细胞数量： 纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上 密度梯度离心法分离PBMCs： 注意事项 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上，使两者形成一个清晰地界面。 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形成的细胞层。