DNA甲基化检测方法.pptVIP

质谱法检测的优势： 灵敏度准确性高。 操作较简便。 局限性： DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。 需用质谱仪。 扩增 基因组DNA样本 重亚硫酸盐 转化 ExoSAP消化 PCR 引物延伸 加入SNP引物和 SNaPshot Mix SNP引物延伸 (加入ddT或ddC) SAP处理 分析 310/3100样本准备 加入GS120LIZ内标 ABI310/3100电泳 选用E5和POP4胶 数据分析 （GeneScan） 样本分型 （Genotyper或GeneMapper ID） 步骤 1 2 3 4 5 6 这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰 代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲 基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率。 HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴定感兴趣的CpG 岛 。 HRM技术原理 HRM技术原理 HRM特点 高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。 高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。 高重复性：重复性100%。 使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。 缺点：检测序列长度不应超过100bp； 只能进行半定量检测 应用十二：焦磷酸测序法 焦磷酸测序法（Pyrosequencing） 焦磷酸测序法（Pyrosequencing） 焦磷酸测序 焦磷酸测序 焦磷酸测序 焦磷酸测序的优势： 灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。 除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。 对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点； 对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。 应用十三：Quantification of Methylated DNA by HeavyMethyl Duplex PCR Principle of HeavyMethyl (A) When the DNA is methylated, the blocker oligonucleotides (solid black) do not bind, leaving the primer binding site accessible for the primers (gray arrows) to bind and amplify the target. The amplication is detected with a methylation specific oligonucleotide probe [solid black, labeled with fuorescent dye (F) and quencher (Q) in a 5’-exonuclease assay, used here as an example for a real-time detection method]. (B) When the DNA is unmethylated, the blocker oligonucleotides bind, blocking the access of the primers to their binding sites. No PCR product is generated. sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment. 不同甲基化检测方法的检测通量 1.筛选Differentially