实验二、三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE.ppt

注意 １、聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 ２、凝胶块不能到入水槽！ 3 、吸取胶的滴管要及时清洗，以免堵塞。 4 、染色液及缓冲液要回收。 5 、 缓冲液倒入电泳槽后再上样。 6 、 要经常注意电泳内槽是否漏液 （电极缓冲溶液应没过短玻璃片）。 * 膠體是一種立體的網狀構造，網目的大小會影響樣本的泳動率： 調配 acrylamide 及 Bis 的濃度，可以控制膠體網目的大小，也因此可以控制樣本分子的泳動率；以此來達到最佳的分離效果。 Acrylamide 的百分比較高者，其網目較小，可以分析較小的分子，通常解析力會較佳；但網目也不能太小，以免蛋白質的巨分子都跑不下來。 经过电泳后的蛋白可以通过不同的方法进行检测，如化学染色、同工酶染色、荧光探针、免疫方法等等。 不同的检测方法检测目的不同，检测灵敏度不同。 考玛斯亮蓝染色是目前最为常用的一种染色方法。考玛斯亮蓝（coomassie brilliant blue）R-250 每分子含有两个SO3H 基团，可以结合在蛋白质的碱性基团上。 检 测 方 法 同时，在较宽的范围内其颜色深浅和蛋白质的量有线性关系，可以进行定量测定。 CH2 N C2H5 C N C2H5 CH2 NH SO3－ OC2H5 SO3Na 考玛斯亮蓝 R-250 五、操作过程 （一）SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯。 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好。 *固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水，静置至胶凝。  * 凝胶配制过程要迅速, 加速剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 1. 30% stock acrylamide(凝胶贮液) 4.0ml 2. 3.0mol/L Tris (pH 8.8) (分离胶缓冲液) 1.25ml 3. 10% SDS (讲台) 0.1ml (2 drops) 4. ddH2O 4.0ml 5. 10% Ammonium persulfate (过硫酸胺,讲台) 0.05ml 6. 2%TEMED 0.6ml 分离胶的配制:12％，10ml Separating gel water * 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡。胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面。  4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝。  * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 1. 30% stock acrylamide 0.75mL 2. 0.75mol/L Tris (pH 6.8) (浓缩胶缓冲液) 0.83mL 3. 10% SDS (讲台) 0.1ml(2 drops) 4. ddH2O 3.0mL 5. 10% Ammonium persulfate (讲台) 0.02mL 6. 2%TEMED 0.3mL 浓缩胶的配制:5%,5ml Stacking gel Separating gel Stacking gel Separating gel 5.拔出样梳后, 用水洗加样孔。并用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。 Water to rinse the cell Stacking gel Separating gel 将pH=8.3的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，电极缓冲溶液应没过短玻璃片。 Electrophoresis buffer Stacking gel Separating gel 6.上样：微量注射器（加样器）上样 （1）marker 15μl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。 （2） 待测样品溶液浓度控制在16～20mg/mL，取0.2 mL与0.05 mL“5×样品溶解液” 混匀，轻轻盖上盖子(不要盖紧,以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中保温2～3分钟，取出冷至室温。 上样顺序 1 2 3 4 5 6 7 BSA 样本 ?样本 mark BSA 样本 ?样本 66200 37KD 37KD 10~170KD 66200 37KD 37KD 20ul 20ul 10