实验3-ELISA免疫标记技术.ppt

下一次实验 酶联免疫吸附试验（ELISA）的后半部分 Medical Immunology Medical Immunology 免疫标记技术（immunolabelling technique） 基于抗原-抗体反应的检测方法 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 定义：用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测技术。 特点：灵敏度高、快速、可定性、定量、定位，无需特殊设备； 目前应用最为广泛 免疫标记技术 immunolabelling technique * 免疫标记技术= 抗原抗体反应 示踪物标记 灵敏性 特异性 标记免疫技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性 免疫技术+标记技术 免疫标记技术 * 免疫标记技术 常见技术 免疫荧光技术 酶免疫技术 免疫组化技术 放射免疫技术 免疫胶体金技术 化学发光免疫技术 免疫印迹 1、免疫荧光法 (immunofluorescence，IF) 免疫荧光实验 * 2、免疫组化技术 用标记的特异性抗体与组织或细胞抗原反应，借助形态学观察，进行组织或细胞抗原的定性、定量和定位检测。 分类 酶免疫组化 免疫金组化 免疫电镜 免疫荧光组化 * 酶免疫组化 主要流程 切片、爬片或滴片制备 检测抗体孵育 酶标抗体孵育 底物显色 复染 制片观察 免疫组化技术 定位、定性、定量检测 特定蛋白（抗原） 可作为抗原的物质有： 酶、 受体、 抗体、 细胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体。 3、放射免疫测定法 (radioimmunoassay， RIA) 放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。 常用核素为125I和131I，分液相和固相两种方法。 常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。 * 4、免疫印迹 将凝胶电泳和固相免疫结合的检测技术 主要流程 提取蛋白样品 凝胶电泳分离 转膜 检测抗体孵育 标记抗体孵育 加反应底物 成像分析 免 疫 印 迹 法 示 意 图 显色 加底物显色 加酶标记抗体（二抗）孵育，洗涤 封闭后洗涤，加特异性抗体（一抗）孵育，洗涤。  5、酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 酶联免疫吸附试验enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游离成分分离。 最常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP） 底物为邻苯二胺 反应显橙黄色 灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平 间接法--检测抗体 双抗体夹心法 ELISA试剂盒： 实验三 酶联免疫吸附试验 -人IgG的测定 （enzyme linked immunosobent assay, ELISA） 基本原理 双抗体夹心法主要用于检测未知抗原， 原理：将已知抗体吸附于固相载体上、洗涤后加入待测抗原溶液，然后洗涤去除未结合的抗原，加入酶标特异性抗体，洗涤并加入酶作用底物使显色、终止反应再检测有色产物。检测的吸光度值和所测定的抗原在一定范围内呈线性关系，利用此特点不仅可对未知抗原定性，还可定量检测。 主要器材 自动酶联检测仪、洗板机、恒温水浴箱、微量移液器、Tip头、废液缸、吸水纸若干、96孔聚乙烯塑料反应板（每组1条）。 主要试剂 1. 兔抗人IgG抗体。 2. 已知含量IgG参考蛋白。 3. 待检血清。 4. 辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体。 5. 包被液：PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。 6. 封闭液：含5%脱脂奶粉的包被液。 主要试剂 7. 待检标本及酶标抗体稀释液：0.02M PBS-T加终浓度0.1%的BSA或5％小牛血清。 8. 洗涤液：含去污剂0.05％吐温20的pH7.4的0.15M磷酸盐缓冲液（防止非特异性吸附）。 9. 底物溶液：临用前新鲜配制，为邻苯二胺（OPD） OPD-H2O2， 底物对光敏感，需避光并立即使用。 10.终止液：2mol/L H2SO4。 实验步骤 1.包被--已知抗体吸附于固相载体：包被液稀释兔抗人IgG抗体至蛋白含量1-10μg/ml。反应板每孔加100μl，置37℃孵育2h后4℃过夜。 2.洗涤-- 倾去包被液，用洗涤液加满各孔，静置3 min，倾去，反复3次。 3.封闭—加封闭液， 37℃孵育60 min，倾去，洗涤3次。 4.加样--加待测标本，同时作空白、阴/阳性对照： (1) 稀释的IgG 参考蛋白作阳性对照，每孔