RT-PCR-步骤(精).docVIP

一、组织抽提： 1.?????? 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末 2.?????? 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3.?????? 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4.?????? 冰上5分钟 5.?????? 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管 6.?????? 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上5分钟 7.?????? 离心12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管 8.?????? 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟 9.?????? 离心12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液 10.?? 加入1 ml 75%乙醇，震荡 11.?? 离心7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液 12.?? 室温下使之变透明 13.?? 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱） 14.?? 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度 二、RT反应体系（第一步）：约20分钟 RNA 抽提物 5μl Radome 引物 2μl RNA sin 0.5μl 1.?????? 65℃ 15分钟2.?????? 立即放入冰浴 RT反应体系（第二步）：约2小时 RNA sin 0.5μl 10mM dNTP 1μl 5×RT 缓冲液 4μl 25mM MgCl2 4μl AMV 逆转录酶 3μl 1.?????? 37℃ 1.5小时2.?????? 94℃ 5-10分钟3.?????? 反应物保存于-20℃或进行PCR 三1、PCR反应体系：约4.5小时 25mM MgCl2 2μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 2.5μl ddH2O 34μl Taq酶 0.5μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1.?????? 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2.?????? 94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环 3.?????? 72℃ 10分钟4.?????? 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 三2、PCR反应体系：约5小时 25mM MgCl2 3μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 5μl ddH2O 30μl Taq酶 1μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1.?????? 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2.?????? 94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环 3.?????? 72℃ 10分钟4.?????? 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 四、电泳：约1.25小时 1.?????? 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml2.?????? 胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶） 3.?????? 微波炉中火2分钟溶解胶4.?????? 冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml） 5.?????? 放入梳子，浇板，待凝固6.?????? 加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰7.?电泳50-80V（每㎝ 5V） 一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC