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用SECs制备siRNA 优点： 可直接由PCR得到，方法简便，时间短 在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效的siRNA可用于构建表达载体 可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配 用表达框架制备siRNA 缺点： PCR产物很难转染到细胞中 不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想 用途： 筛选siRNA序列 在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子 shRNA(short hairpin RNA) 文库 Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March) 针对：9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成：28,000个shRNA表达盒(cassettes) 商品化试剂盒：Expression Arrest? (美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司) 网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程 CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点 Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列 siRNA shRNA 使用代价 高 相对较低 持久性 最多2周 可选择获得稳定整合的细胞 宿主类型 细胞系 原代细胞，胚胎干细胞、细胞系 设计 复杂的设计方法 完成 获取 需要合成 完成 应用 瞬时转染 瞬时转染、稳定转染、病毒侵染 检测方法 Western杂交、表型分析RT-PCR、芯片检测 Western杂交、表型分析、RT-PCR、芯片检测 研究领域 细胞培养 细胞培养体内研究 siRNA转染细胞 .磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法 ：显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂 提高转染效率的方法 纯化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 较低传代数的细胞 合适的转染试剂 合适的阳性对照 荧光标记的siRNA RNAi技术的应用 基因组功能研究的新方法 研究信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略 （抗病毒、抗肿瘤等） 筛选药物靶点的新工具 RNAi技术抗病毒 作用 阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录 自然界中普遍存在 在医学上的应用 RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒 DNA病毒：如HBV RNAi技术阻止HIV的入侵 Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细胞系），能使细胞表面CD4 表达减少75%；转染后60 小时后, 再用H IV 感染, 结果发现CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现 其它试验的受体： CCR 5、CXCR4 RNAi技术抑制HIV的复制 将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制 siRNA抑制HIV rev-EGFP的表达，其抑制率可达到90％；而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异 RNAi技术抑制HCV的复制 NS5B-6133 siRNA NS3-1948 siRNA GAPDH siRNA + + + HCV表达质粒 Huh-7 细胞 共转染 HCV RNA ↓ 21倍 HCV RNA ↓ 23倍 HCV RNA 无变化 谢 谢! RNA干扰技术基本原理与应用 什么是RNA干扰 RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降. 2001、2002年连续被Science评为年度十大成就! 目前应用的基因干扰技术 DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子 目前应用的基因干扰技术 mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性mRNA 设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术（RNAi） RNAi的发现和发展历程 1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验 “共抑制(co-suppresion)” RNAi的发现和发展历程 1995年 Su Guo 和Ken Emphues