针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（６）：５５６０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 针对人ＴｕｄｏｒＳＮ蛋白Ｔ１０３位点的应激磷酸化 抗体制备及分析 １ ２ １ １ ３ １ ３ 高星杰 　张　毅 　苏　超 　付　雪 　史雪彬 　尹　洁 　何津岩 ３ ３ １，３ 　王鑫廷 　姚　智 　杨　洁 （１天津医科大学基础医学研究中心　天津　３０００７０　２天津医科大学药学院　天津　３０００７０） （３天津医科大学 基础医学院　天津　３０００７０） 摘要　目的：针对人ＴｕｄｏｒＳＮ蛋白Ｔ１０３位点（１０３位苏氨酸，Ｔｈｒ１０３）制备兔源多克隆磷酸化抗 体，并进行应激磷酸化的时相分析。方法：首先人工合成含磷酸化Ｔ１０３（ｐＴ１０３）位点的多肽，４次 免疫新西兰大白兔后获取抗血清；然后以ＡＫＴＡ蛋白纯化系统进行纯化，并利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗ｐＴ１０３抗体进行鉴定；最后以ＩｎｃｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ法进行ＴｕｄｏｒＳＮ 蛋白的应激磷酸化／去磷酸化时相性分析。结果：（１）确定并合成磷酸化多肽“ＴＩＥＮＫｐＴＰＱＧＲＣ”， 收集约７５ｍｌ兔源抗血清，纯化后获取２．０８ｍｇ／ｍｌ抗ｐＴ１０３抗体；（２）当ＨｅＬａ细胞受到氧化应激 时，以ｐＴ１０３抗体检测的磷酸化信号增强，可在胞浆中检测到颗粒状信号，与内源性ＴｕｄｏｒＳＮ应 激颗粒存在共定位关系；（３）在氧化应激及应激去除后恢复过程中，Ｔ１０３位点的磷酸化水平呈现 一定的波动性时相。结论：成功制备针对ＴｕｄｏｒＳＮ蛋白Ｔ１０３位点的兔源多克隆抗ｐＴ１０３抗体， 有助于从磷酸化修饰角度进行ＴｕｄｏｒＳＮ在细胞应激方面的机制探讨。 关键词　ＴｕｄｏｒＳＮ　磷酸化　抗体　应激颗粒 中图分类号　Ｑ７１ ［１］ ［９１１］ 　　人类ＴｕｄｏｒＳＮ蛋白参与基因转录 、ｐｒｅｍＲＮＡ剪 对于ＳＧｓ的形成起重要的调控作用 。本文即是针 ［２］ ［３］ 对ＴｕｄｏｒＳＮ应激蛋白Ｔ１０３位点进行兔源多克隆磷酸 切 、细胞凋亡 等多种生物学过程。本课题组前期研 究结果表明，当真核细胞受到外界刺激如０．５ｍｍｏｌ／Ｌ亚 化抗体的制备以及初步分析。 砷酸钠氧化应激或４５℃热休克时，ＴｕｄｏｒＳＮ蛋白可与 １　材料与方法 Ｇ３ＢＰ（ＲａｓＧＡＰＳＨ３ｄｏｍａｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白结合， 在胞浆中呈颗粒状聚集，参与应激颗粒（ｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅｓ， １．１　材　料 ［４］ １．１．１　细胞及实验动物　ＨｅＬａ细胞来自本实验室；新 ＳＧｓ）的构成 。ＳＧｓ是真核细胞受到氧化应激、病毒 西兰雄性大白兔２只，体重２．５ｋｇ，兔龄４～５个月，由 感染等外界刺激时形成的与ｍＲＮＡ代谢密切相关的颗 ［５８］ 本校实验动物中心提供。 粒状结构 。研究发现，多种应激蛋白的磷酸化修饰 １．１．２　试剂与仪器　ＢＣＡ蛋白测定试剂盒购自Ｐｉｅｒｃｅ 收稿日期：２０１４