定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展-中国医药生物技术.PDFVIP

464 中国医药生物技术 2014 年 12 月第 9 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2014, Vol. 9, No. 6 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.010 ·综述· 定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展 张志来，陈建华 定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复改造遗 已成功应用于蛋白质工程、生物医药等领域，是基因定向进 传多样性，结合文库高通量筛选而获得理想性状生物体的过 化的最有效的方式，在蛋白生产和研究中是应用最成功的技 [5] 程，现已成为在基础生物学和应用生物学领域应用最广泛和 术之一 。 最有效的技术之一。目前已成功应用于蛋白质的研究和开 近年来，随着对 DNA 改组的不断完善和改进，新的 发。蛋白质在生物催化、生物医药等领域具有广泛的应用。 依赖于同源重组的定向进化技术不断涌现，如交叉延伸 [6] [7] 如何提高目的蛋白的产量、改善蛋白质的理化特性以及构建 PCR （StEP ）技术 、随机链交换法（RAISE ） 、随机引 [8] 、临时模板随机嵌合（RACHITT ） 具有新催化活性的蛋白质以满足日益增长的需求是亟待解 物体外重组（RPR ）技术 决的问题。而定向进化技术的发展为实现这样的目的提供了 技术[9]等（图 1 ）。而基于同源重组的定向进化技术，需要 强有力的技术支持。本文就定向进化技术在蛋白质开发中的 待改造的基因具有一定的同源性，无法有效地在非同源性或 应用进行了综述。 同源性低的亲本中应用，同时文库的多样性往往无法达到理 想的需求。因此，一些基于非同源重组实现随机突变的技术 1 定向进化技术 应运而生，如 SCRATCHY 文库[10] 、随机多重 PCR[11] 、外 与理性突变方法相比，定向进化技术具有独特的优势： 显子改组[12]等。 突变体的构建无需受蛋白质结构信息的限制。早先的定向进 化技术的靶标多数是单个蛋白，通过随机或定点插入突变， 获得稳定性更好或催化活性更高的突变体以适应工业化要 求。而近年来的趋势则转向于对代谢途径甚至是基因组水平 进行改造，以创造新型全细胞催化剂用于合成有价值的生物 [1] 产品 。 目前，比较经典的定向进化技术有易错 PCR 技术和 DNA 改组技术等，而新兴的技术则是在这两种技术的基础 上改进发展起来的。 1.1 易错 PCR 技术 A B C D [1] 易错 PCR 是利用 Taq DNA 聚合酶，或改变 PCR 反 图 1 几种常见定向进化技术流程图 [A ：易错 PCR ；B ： 应体系的条件，在 DNA 聚合过程中随机引入错配碱基， 点饱和突变；C ：DNA 改组；D ：交叉延伸 PCR （StEP）] 其突变位点发生在分子内部，是应用最早、最成熟的一种定 [2] 。易错 PCR 无需改变基因的长度，突变频率