实验五_食品中大肠菌群的测定-公开课件.pptVIP

实验五 食品中大肠菌群的计数;1、??了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。?? 2、练习并掌握大肠菌群的检验方法?。;二、原理;;该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群最可能数MPN（the?most?probable?number-简称MPN）表示;三?、?材料;除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。;月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤、 煌绿乳糖胆盐（BGLB ）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ) 、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH ) 、 1mol/L 盐酸（HCI ) 。 ;第一法 大肠菌群MPN计数法。 第二法 大肠菌群平板计数法。 ;试验流程;? 1、样品的稀释 （1） 固体和半固体样品 称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-10000r/min 均质1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。;（2） 液体样品 以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。 （3） 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。;;（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。;?（5）、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。;每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。;记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。;用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。;?根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。 注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。 ;第二法 大肠菌群平板计数法;大肠杆菌0157显色培养基上的菌落;在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上 ;大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征;大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征 ;大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征 ;26;试验流程;1、 样品的稀释;（1） 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。 （2） 及时将15 mL-20mL冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。;? （3） 平板菌落数的选择 选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。;? （4）、 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。;?（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。