基因工程工程菌构建课件.pptVIP

1，3-丙二醇性质 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点211℃，自燃温度为400℃。 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。 。 1，3-丙二醇用途 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业14j。 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品，产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料 。 1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tac-yqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。 。 1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线 (1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建 重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考察其转化甘油的能力。 (2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac—dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。 (3)在摇瓶水平，对已构建的产1，3．丙二醇重组菌EcoliJMl09 发酵条件的初步研 。 1，3．丙二醇生物合成途径 l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇 。 。 一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达 。 1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要试剂： 质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 材料 。 （一）、质粒DNA的提取 (1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培养过夜。 (2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min，离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀， 。 6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。 。 (二)、大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL， 。 轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。 (7)8000r／min离心5min，然