DNA、RNA提取的差别讲解.ppt

DNA、RNA提取的差别 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。 核酸的理化性质 提取DNA、RNA总的原则 : 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，也应尽量去除。 核酸提取的基本步骤 1.材料准备 2.破碎细胞或包膜－内容物释放 3.核酸分离、纯化 4.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? 5.核酸溶解在适量缓冲液或水中 DNA和RNA提取的主要差别 DNA和RNA的降解 DNA不易降解 RNA易降解 　浓盐法： 　有机溶剂抽提法： 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 基因组DNA的提取 　吸附材料结合法 非基因组DNA的提取 碱裂解法 密度梯度离心法 煮沸法 　质粒DNA的提取 SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液 组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA－SDS法 RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 异硫氰酸胍/苯酚法 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 RNA提取的通用方法 TRIzol试剂提取RNA、DNA TRIzol试剂有多组分分离作用,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质． TRIzol使样品匀浆化, 因同时含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性. 加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相 水相：RNA----异丙醇沉淀回收； 中间层：DNA----乙醇沉淀回收； 有机相：蛋白质----异丙醇沉淀回收 NaI法提取外周血细胞基因组DNA 实验结果：λ260=0.123Abs; λ280=0.086Abs Ratio=1.43 实验结果分析：DNA含量低且不纯,蛋白杂质含量多 原因分析：裂解不充分，沉淀不完全，洗涤时DNA丢失 氯仿抽提不充分，洗涤不充分 即非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。 * DNA提取时RNA因为不稳定，所以易被降解，在实验中可以不添加RNA酶，也可以选择添加RNA酶，以最大限度提高DNA纯度。 RNA时要严格操作，并用专用的处理过的试剂提取，避免RNase的污染。杜绝外源酶污染，阻止内源酶活性 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 若RNA中含DNA，可使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA * TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性.在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质 苯酚/氯仿提取法原理 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性 SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA