外植体接种与培养.ppt

第一节 外植体的接种 1 接种室的消毒 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。 使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 2 外植体的接种 接种：是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。 第二节 培养方法 1 固体培养 优点: 简单，应用广泛，一般只要有培养室及接种箱即可开展工作。 缺点: 外植体或愈伤组织只有底部表面接触培养基，吸收养分，造成各部分营养浓度差异，影响生长。 外植体插入培养基后，气体交换不畅及排泄物质积累，影响组织吸收和造成毒害。 受光不均匀，生长不一致。 2．液体培养 分静止培养和振荡培养： 2.1 静止液体培养 优点：培养基中不出现营养物浓度差异的现象，可以用来进行许多营养方面的研究工作。 静止培养不需增添专门设备，适合于某些原生质体培养； 1）25±2oC。 2）植株种类及外植体的不同，其最适温度也是不同的。 如百合20℃；月季25-27℃；番茄28℃。 低于15?C或高于35?C，对生长都是不利的。 1 褐变的原因 2 影响褐变的因素 3 褐变的预防措施 2.1 植物材料 （1）基因型 不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。 木本植物一般比草本植物容易发生褐变。 木本植物木质素、单宁含量或色素含量高。而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体。 （2）材料年龄 幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。 幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。 （4）取材时期 多酚氧化酶活性和酚类含量基本对应，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强。 光照与温度。 温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。 2.3 培养基 （1）培养基状态 液体培养基可有效克服外植体褐变。 在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。 （2）无机盐 在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。 原因：无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子。 （3）植物生长调节物质 黑暗条件下，生长调节物质的存在会影响褐变，此时去除生长调节物质可减轻褐变。 细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。 生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。 （4）抗氧化剂 抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。 常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC、硫代硫酸钠等。 （5）吸附剂 活性碳和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应， （6）pH值 培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。 而pH值升高则明显加重褐变。 2.4．材料转瓶周期 对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。 缩短转瓶周期可减轻褐变。 1 褐变的原因 2 影响褐变的因素 3 褐变的预防措施 3 褐变的预防措施 3.1．选择适宜的外植体 外植体应选择分生能力较强的材料。 如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。 3.2．采用适宜的培养基和光温条件 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d～40d，可以显著减轻材料的褐变。 3.3．培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 0.1%～0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。 加抗坏血酸、血清白蛋白、有机酸、蛋白质、蛋白质水解产物、氨基酸、硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、亚硫酸氢钠、氰化钾、苏糖二硫醇等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。 3.4 缩短转瓶周期对 容易褐变的材料可间隔12～24小时培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。 第五节 试管植物的玻璃化现象及其预防措施 1 外植体的玻璃化 2 玻璃化苗的危害性 3 玻璃化的原因 4 玻璃苗发生的机理 5 预防玻璃化的措施 1 外植体的玻璃化（vitrification） 是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白