胶质瘤细胞中干细胞分离的实验研究.docVIP

胶质瘤细胞中干细胞分离的实验研究 何麟 蔡洪 刘谊 陈忠 邹昆良邓功建(四川达州市中心医院635000) 【中图分类号】R73-3 ［文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2012) 30-0072-03 【 】目的研究应用无血清培养基悬浮法培养U-251胶质瘤细胞系的方法; 并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞，鉴定其特异性标志物CD133+的表达并观察 其牛长和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法，在无 血清培养基中采用悬浮法培养人U?251胶质瘤细胞系；再将分离获得的悬浮牛长 的脑肿瘤干细胞利用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133+在脑肿 瘤干细胞球中的表达。再将脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基，观察其分化牛长 和分化特征。结果U?251胶质瘤细胞系中有约(2.56plusmn;0.2) %的肿瘤细胞 在无血清培养基中能够存活，增殖，形成自由漂浮的细胞球；其细胞表达CD133+ 神经干细胞的标志物，并可连续传代，若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁 分化，贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的U-251胶质瘤细胞系 无明显差别。结论用悬浮无血清培养法从U?251人胶质瘤细胞系中成功培养出 脑肿瘤干细胞，其肿瘤干细胞能够产牛为多种细胞形态的分化细胞，脑肿瘤干细 胞的分离培养成功对脑肿瘤的基础和临床研究具有重要价值 【关键词】U-251人胶质瘤细胞系脑肿瘤干细胞悬浮法培养无血清培养基 脑肿瘤居成人恶性肿瘤发病率前十位，其发病率和死亡率不断升高，严 重地威胁着人类健康和牛命。虽然外科手术和其他治疗措施进展很快，但仍很难 治愈，经手术(放疗和化疗治疗后，病人几乎无一例外地出现肿瘤复发。在过去 的20多年中，脑胶质瘤的治疗一直无明显进展［1］,最近研究发现，脑肿瘤中存 在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell, BTSC),是引发肿瘤并维持脑肿瘤的生长的细胞来源(tumor-initiating cell, TIC), 在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用［2］。肿瘤干细胞(cancer stem cells)是存 在于肿瘤中含量较少的具有干细胞性质的细胞群体，它具有自我更新的能力，是 形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的根源。肿瘤干细胞的消灭就意味 着消灭了肿瘤。 本实验中,我们使用成分相对简化成本较低的无血清培养基，应用悬浮培 养NSC (Neural stem cells,NSC)的实验方法，从U-251中成功分离培养出具有增殖 形成BTS能力和分化能力的BTSC并连续传代。这种悬浮培养方法简便快捷，能有 效地分离和传代BTSC,为BTSC的深入研究提供了材料。 1材料和方法 1.1材料 U-251C人胶质瘤细胞人由昆明医学院附属第一医院免役治疗中心提供, 表皮生长因子(购买于PEPROTECHEC公司)，脸性成纤维生长因子(购买于 PEPROTECHEC公司),DMEM/F12C购买于GIBCO公司),N2添加剂(购买于GIBCO 公司),CD133 一抗(购买于SIGMA公司),L■谷氨酰胺(购买于AMRESCO公司)， 羊抗小鼠IG?FITC二抗(购买于昆明贝吉尔科技有限公司)。 1.2方法 1.2.1细胞培养基 传统含血清培养基(serum?supplemented medium,SSM)为含10.00%小 牛血清的DMEM/F12(1： 1)培养基，并添加L■谷氨酰胺(2mmol/L)?胰岛素(4u/L), 青霉素 G(ltimes;105u/L),链霉素(lOOmg/L),无血清培养基(serum-free medium,SFM),^J不含胎牛血清的DMEM/F12 (1： 1)培养基，并添加重组人表皮 生长因子(epide-rmal growth factor,EGF?PeproTech)^重组人碱性成纤维生长因 (basicfibrob last growth factor,bFGF,PeproTech) 其它成分同上。 1.2.2U-251中BTSC的分离培养与传代 先将U-251接种于传统SSM中，在培养瓶中传代。待细胞处于对数生 长期，用D-Hanks液清洗，胰酶(0.25%)消化，自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬 液，悬于SFM,台盼兰染色并计数，以ltimes;106孔接种于6孔板，在37°C、 5.00%,饱和湿度培养箱中培养。待BTSC增殖形成肿瘤干细胞球(brain tumor sphere,BTS) 3,4d后将其收集并机械吹打成单细胞悬液,重悬于SFM,按1:4的比例 传代于6孔板。U?251接种于传统SSM中，连续传代观察作为对照。 1.2.3有限稀释、单克隆形成实验 将贴壁生长于SSM中的