酶促反应法测定生物化学物质.pptVIP

第二十六章酶促反应法测定生物化学物质 贵阳医学院 潘卫 第*页 血浆碳酸氢根 测定方法概述 血浆HCO3-测定方法主要有离子选择电极法、滴定法和酶速率法等。酶速率法为HCO3-直接参与化学反应，操作简单，反应特异，更适合临床常规检测。 第*页 酶法测定血浆碳酸氢根 血浆中的HCO3-在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下，与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和苹果酸脱氢酶（MDH）反应，生成苹果酸，同时将NADH氧化成NAD+；在340nm波长处吸光度的降低与样品中HCO3-含量成正比。 第*页 ① 在准备试剂和收集标本时，应严格密封，以最大限度地减少干扰如标本中CO2的挥发； 酶法测定血浆碳酸氢根 性能评价 ②试剂浑浊或试剂空白吸光度小于1.0时都不能使用； ③内源性丙酮酸和LD对反应产生干扰，此干扰可由草氨酸钠消除。 第*页 第*页 四、血清总胆固醇 三、血清三酰甘油 一、葡萄糖 第三节 过氧化物酶指示系统测定法 过氧化物酶 指示系统 测定法 二、糖化血清蛋白 五、血清HDL-C和LDL-C 第*页 Trinder反应指示终点 生化物质在氧化酶的催化下，生成H2O2 过氧化物酶指示系统是临床生化物质 最常用的测定方法 概述 第*页 葡萄糖 测定方法概述 葡萄糖的检测方法较多，可归纳为氧化还原法（无机化学法）、缩合法（有机化学法）和酶法（生物化学法）三类。 酶法包括葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法、己糖激酶（HK）法、葡萄糖脱氢酶法和葡萄糖氧化酶-氧速率（GOD-POR）法。 第*页 葡萄糖氧化酶法测定 葡萄糖 根据GOD可以高特异性的催化葡萄糖氧化成为葡萄糖酸并同时产生H2O2，生成的H2O2参与Trinder反应，生成醌亚胺色素，在505nm波长下比色检测，生成的吸光度与葡萄糖浓度成正比。 第*页 ① GOD仅高特异的催化β-D-葡萄糖，而葡萄糖中α型约占36%，因此葡萄糖的完全氧化需要使α型变旋为β型； 葡萄糖氧化酶法测定 葡萄糖性能评价 ② 现在的试剂大多含有变旋酶，可促进α型向β型的转变，延长孵育时间也可以达到自发变旋。 第*页 糖化血清蛋白 测定方法概述 血清清蛋白在高血糖情况下会发生糖基化，主要是清蛋白肽链189位的赖氨酸与葡萄糖结合形成的高分子酮胺结构，该结构类似于果糖胺，因此糖化血清蛋白（GSP）的测定也称为果糖胺的测定。 GSP的常用测定方法有硝基四氮唑蓝（NBT）化学比色法和酮胺氧化酶（KAO）法。 NBT法基于酮胺结构可以在碱性环境中与NBT反应生成蓝紫色的化合物。与NBT法相比，KAO法的精密度和准确度更高。 第*页 酮胺氧化酶法测定 糖化血清蛋白 GSP在蛋白酶K的作用下可形成糖化蛋白片段，该片段在KAO的作用下分解为氨基酸、葡萄糖和H2O2，生成的H2O2即可用Trinder反应测定。 第*页 ① KAO法稳定，特异性强，具有酶法的基本优点； 酮胺氧化酶法测定糖化 血清蛋白性能评价 ② 样本在4℃可保存3周，-20℃保存5周。当病人血浆蛋白低于35g/L时，GSP偏低。 第*页 血清三酰甘油 测定方法概述 血清三酰甘油（TG）测定方法有物理化学法（同位素稀释-质谱法）、化学法和酶法三类。 酶法是目前临床测定血清TG的常规方法。常用的酶法有甘油磷酸脱氢酶（GDH）法和GDH偶联NBT的比色法，以及甘油磷酸氧化酶偶联Trinder反应法。 第*页 甘油磷酸氧化酶法测定 血清三酰甘油 血清TG可被LPL水解为甘油和脂肪酸，生成的甘油被甘油激酶（GK）及ATP磷酸化后形成3-磷酸甘油，磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化3-磷酸甘油产生H2O2，生成的H2O2参与Trinder反应而被测定。 第*页 ④与GDH法相比，该方法易受到还原性物质的干扰，但是由于方法稳定，测定简单，仍然是目前主要采用的检测方法。 ③由于乳糜微粒含有大量的TG，可影响检测结果，因此需空腹12h以上采血； ②该法可采用血清或血浆标本，若采用血浆，应将结果乘以标准系数1.03，并在报告单上注明； ①该法通常被称为GPO-PAP法，结果比GDH法约低3% ； 甘油磷酸氧化酶法测定 血清三酰甘油性能评价 第*页 血清总胆固醇 测定方法概述 血清总胆固醇（TC）测定方法种类繁多，主要有放射性核素稀释-质谱法、化学法和酶法。 酶法的主要方法为胆固醇氧化酶（COD-PAP）法。 第*页 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇 根据GOD可以高特异性的催化葡萄糖氧化成为葡萄糖酸并同时产生H2O2，生成的H2O2参与Trinder反应，生成醌亚胺色素，在505nm波长下比色检测，生成的吸光度与葡萄糖浓度成正比。