蛋白质和酶工程第五章酶和细胞固定化.ppt

由于动物细胞的极度敏感性, 植物细胞固定化方法会对动物细胞产生毒性, 另外多糖(如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害 故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法, 如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化 2、固定化原生质体 一、原生质体固定化的方法 制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。 关键：原生质体如何制备？ 二、原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原生质体——活性鉴定 三、酶解注意要点 1、酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。 采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。 一般加入：巯基乙醇，Triton-100，甘氨酸、青霉素。 2、酶系选择： 溶菌酶、蜗牛酶、β葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 3、酶浓度选择（0.5%-1%） 4、酶解温度和pH 5、酶解终点确定 四、稳定剂（高渗溶液）要求 1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性 2 不会影响水解酶的活性 3 对代谢产物无不良影响 稳定剂加入操作注意点 1、一定pH （酶和菌体活性最高） 2、一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩） 3、种类：无机盐——细菌 有机物糖和糖醇——酵母 4、易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂 五、原生质体细胞活性的检测 1 荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 2 酚藏花红染色法 3 伊文思兰染色法 六、辅酶固定化 1、原理 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应（递氢、递电子或递某些化学基团的作用） 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵 ——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生 2、固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 3、辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 策略：先在辅酶的一定部位进行修饰--引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）-- 再与水溶性高分子结合 辅酶的固定化 辅酶再生的形式： 辅酶和酶共固定 与酶分子偶联成辅酶-酶复合物 * * * * * 此法近似于植物体内物质的传递与交换形式，有利于细胞生长和新陈代谢的进行 中空纤维作为固定化载体的缺点 有时纤维管会阻塞而影响物质传递 中空纤维成本较高，难以大规模生产利用 吸附法优缺点 操作简便易行 对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响 吸附力较弱、吸附不牢固 细胞容易脱落，使用受到一定的限制 2.2包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部 凝胶包埋法 以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法。细胞经包埋固定后，被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢 半透膜包埋法 凝胶包埋法 应用最广泛 适用于各种植物细胞、动物细胞和微生物细胞 使用的载体 海藻酸钙凝胶、角叉才胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、琼脂等 ①琼脂凝胶包埋法 也可将琼脂细胞混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化细胞胶层切成所需的形状 缺点 琼脂糖凝胶的机械强度较差 氧气、底物和产物的扩散比较困难 应用受限 细胞工程 黄林彬 lbhuang@ 琼脂凝胶 ②海藻酸钙凝胶包埋法 操作简便、条件温和、对细胞无毒性 通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合多种细胞的固定化 磷酸盐（营养液中）会破坏凝胶的结构，应控制好其浓度 在营养液中保持一定浓度的钙离子，维持凝胶结构的稳定性 海藻酸钙凝胶 ③角叉菜胶包埋法 溶解、灭菌、冷却到35-50℃ 与细胞悬浮液混匀后滴到预冷的氯化钾溶液中，制成小球状固定化细胞胶粒 也可按需制成片状或其它形状 凝聚成型时可使用其它阳离子，如NH4+、Ca2+等 角叉菜胶具有一定的凝胶强度、对细胞无毒害 通透性较好，是一种良好的固定化载体 应用广泛 ④明胶包埋法 明胶是一种蛋白质，易受蛋白酶的分解 高压蒸汽灭菌，105℃，1.05 MPa，15分钟 冷却至35℃以上 ⑤聚丙烯酰胺凝胶包埋法 机械强度高，孔径与丙烯酰胺浓度相关 但丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，应尽量缩短聚合时间 ⑥光交联树脂包埋法 在光的作用下分子间发生交联反应，生成不溶性网状聚合物——光交联树脂 作用原理：在一定波长的光引发下，带有可以发生光交联反应官能团高分子之间发生加成性交联聚合反应，生成不溶性交联产物 为了增加光敏感范围，此类树脂在使用时有时需要加入光敏化剂 固定过程 不同分子量的预聚物形成不同孔径的树脂，适合多种不同直径的细胞固定 光交联树脂