三酶联免疫吸附试验ELISA.ppt

实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 实验内容： 间接法测定溶血素 ——定性检测 实验材料 脱纤维绵羊红细胞—— 抗原 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）—— 待测兔血清 HRP标记羊抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40μL 酶标板，酶标仪 实验方法 实验方法 预期结果 阳性：显色为黄色 阴性：无色 注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。 2.补体结合反应（Complement fixation Test, CFT） 概念： 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。 原理： 补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。 材料： 抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：56℃，30min 补体：豚鼠血清 2%绵羊红细胞 溶血素 方法： 预期结果： 注意事项： 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。 各种试剂的吸管不可混用。 * 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 3. 原理（以间接性ELISA为例）： 显色 1.抗原的处理： 脱纤维绵羊血 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1：400备用 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，湿盒内，18h 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴性 空白 阳性 待测 4.加二抗： 37℃，湿盒内，30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，湿盒内，30min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色，10min 6.观察结果 1 2 3 4 阴性 阴性 阳性 阳性 待测系统 抗原+未知血清 1 2 补体 1 2 Step 1 抗原抗体复合物的形成 Step 2 补体的结合和耗竭 指示系统 SRBC+抗SRBC抗体 Step 3 SRBC的裂解 1 2 1：No Ab； 2：Ab Ag 待测血清 Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag 1 2 3 4 5 试验管 血清 对照管 抗原 对照管 补体 对照管 SRBC 对照管 待测血清 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.4mL 0.8mL 抗原 补体 N.S