叶绿体的分离、纯化及荧光观察课件.docVIP

山东大学实验报告 科目 细胞生物学实验 姓名 *** 系年级 2011 级生物基地 学号 *** 日期 2013.05.16 同组者 *** 叶绿体的分离、纯化及荧光观察 【实验目的 】 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、 形状和密度， 也同离心力以 及悬浮介质的粘度有关。 通过控制离心力和离心时间等因素， 不同的细胞器可以 通过阶梯离心的方式得到分离。 在一给定的离心场中， 同一时间内， 密度和大小 不同的颗粒其沉降速度不同。 依次增加离心力和离心时间， 就能够使非均一悬浮 中的颗粒按其大小、 密度先后分批沉降在离心管底部． 分批收集即可获得各种亚 细胞组分。 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器， 利用低速离心即可分离集中进行各 种研究。叶绿体的分离应在等渗溶液 ( 0.35mol/L 氯化钠或 0.4mol/L 蔗糖溶液) 中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 将匀浆液在 1000r/min 的条件下 离心 2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。 然后，3000r/min 的条件下离心 5min，即可获得沉淀的叶绿体 ( 混有部分细胞核 ) 。分离过程最好 在 0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。 某些 物质在—定短波长的光 ( 如紫外光) 的照射下吸收光能进入激发态， 从激发态回到 基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光 ( 如可见光) ，这种光 就称为荧光． 若停止供能荧光现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射 后直接发出荧光， 称为自发荧光 ( 或直接荧光 ) ，如叶绿素的火红色荧光和水质素 的黄色荧光等。 有的生物材料本身不发荧光， 但它吸收荧光染料后同样也能发出 荧光，这种荧光称为次生荧光 ( 或间接荧光 ) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色 荧光。 叶绿素吸收的光能主要用于光合作用。 多余的能量可能以热的形式散发， 也 可能以激发光的形式散发。 这种激发光就称为叶绿素荧光。 叶绿素荧光检测技术 作为一种强大的工具，广泛应用于生态学和植物生理学研究。 利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时， 将受到许多因素的影响， 如温 度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外， 1 山东大学实验报告 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。 【实验材料 】 1.试剂：0.35mol/L 氯化钠溶液， 0.01 ％吖啶橙。 2.器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、 普通光学显微镜、 荧光显微镜、500ml 烧杯、量筒、滴管、 10ml 刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻 片和盖玻片。 3.材料：新鲜菠菜。 【实验步骤 】 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称 30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机； 2.利用组织捣碎机低速（ 5000r/min ）匀浆3-5min ； 3.将匀浆液用 6层纱布过滤到 500ml 烧杯中； 4.取滤液4ml 于离心管中， 1000r /min 下离心2min。弃去沉淀； 5.将上清液取出于另一只离心管中， 3000r/min 下离心5min，弃去上清液，沉淀 即为叶绿体（混有部分细胞核） ； 6.将最后一次的沉淀用 2-3ml 0.35mol/L 氯化钠等渗溶液悬浮； 7.取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 8.另取叶绿体悬液一滴滴在载片上，再滴加一滴 0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片 后即可以在荧光显微镜下观察。 【实验结果 】 1. 普通光学显微镜下，对叶绿体的观察：可看到叶绿体为绿色橄榄形。 叶绿体 普通光学显微镜（ 10×40） 2.荧光显微镜下，对叶绿体的观察：叶绿体自发荧光为火红色，呈斑状分布，其 他部分为黑色。 2 山东大学实验报告 叶绿体 荧光显微镜下照片截图 3.吖啶橙染色后荧光显微镜下，对叶绿体的观察：叶绿体可发出桔红色荧光，占 很少一部分，其中混有的细胞核则发绿色荧光，其他大部分为绿色。 叶绿体 细胞核碎片 荧光显微镜下周照片截图 【 实验结果分析 】 1. 普通光学显微镜下观察到叶绿体的正常结构， 离心不彻底导致混有其他组织碎 片。 2. 叶绿体经激发光波照射后， 自发荧光呈现火红色。 因叶绿体在其悬液中呈现点 状均匀分布， 且悬液其他组分无自发荧光反应， 故观察到斑状分