细胞破碎方法.ppt

* 细胞破碎过程中产生的细胞碎片，必须除去，以免污染或赌塞纯化蛋白质所用 的色谱柱。 通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。经过处理的原材料中的有效成分，可用缓冲液或稀酸、稀碱、有机溶剂(如丙酮、乙醇)等溶液抽提，有时还可用蒸馏水抽提。 理想的抽提溶液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 角转子中的离心管能够保持固定的角度离心，可以使用较高的转速，离心后沉淀位于管底的斜面。 * 离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ˉ，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。 为方便起见，F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g (约等于9.8m/s2 )得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。 角转子中的离心管能够保持固定的角度离心，可以使用较高的转速，离心后沉淀位于管底的斜面。 * 水平转子配有2或4个吊篮，静止时垂直挂在转子上，吊篮有不同的适配器以满足不同容量的离心管的需要。当转子转速超过600rpm后离心管达到水平位置，样品沉降方向是沿离心管轴向移动，最后沉降在管底，便于收集。因为不如固定角转子稳固，水平吊篮最高转速相比固定角转子要低很多，限于低速离心的范围。吊篮有不同的适配器，可以放置各种类型的离心管，甚至满足平板离心的需要——例如eppendorf的大容量离心机可配多用途适配器，使得多个微孔板或者培养板、深孔板、PCR板、玻片盒、大规模核酸纯化试剂盒的纯化板、甚至细胞培养瓶的离心可以和大容量的离心瓶公用同一个水平转子，有助于节约经费同时满足多样化的需求。所以说选择适配范围越宽的转子越好。 * 离心法创始人--瑞典蛋白质化学家 用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 沉降速度：单位时间内颗粒下沉的距离 V=D2(γ1-γ2)g/18μ g= ω2r ω=πn/30 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“f”由下式定义，即： f = m?a = m?ω2 r?a — 粒子旋转的加速度， m — 沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度， r—粒子的旋转半径( cm )。?通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ rcf ”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000×g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2），此时“rcf”相对离心力可用下式计算：rcf = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min )? ?由上式可见，只要给出旋转半径r，则rcf和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“ra v”代替： ra v=( r min＋rmax) / 2? 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。 * * Cathepsin 组织蛋白酶 蛋白质纯化过程中为什么遵循步骤尽量少，操作时间尽量短，低温操作？ 比酶活： 定义，纯化的和粗提液比酶活比较。 选择缓冲液原则？ 如何配置缓冲液？ 细胞破碎方法 压榨法：压榨是一种温和的、 彻底破碎细胞的方法。 缺点是仪器费用较高。 细胞破碎方法 化学法：脂溶性溶剂或SDS(十二烷基磺酸钠)等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂。 Fractionation（分离）: Centrifugation is the most widely used procedure to separate the homogenate into different parts, or fractions. 离心机 固定角转子 F=Mω2r 悬浮式转子（水平转子） 沉降系数 （sed