慢病毒包装原理-介绍课件.docVIP

慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒 （ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基 因治疗载体。 区别一般的逆转录病毒载体， 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 慢 病毒载体的研究发展得很快， 研究的也非常深入。 该载体可以将外源基因有效地整合到宿主 染色体上， 从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、 心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果， 在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差， 转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的， 因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到 细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制 效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断 基因表达的作用。 在所构建的 siRNA 表达载体中， 是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合 成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止， 在转录产物 3 端形成 1~4 个 U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是 启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构 （ stem loop ）。在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动 子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA) ，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T 转录终止位点之间 的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 突出端的茎环结构，在细胞内进一 步加工成 siRNA 。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA ，然后 从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA 表达载体。 慢病毒载体（ Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有 效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。 慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒， 在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ，实现在多 种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默， 为在原代的人和动物细 胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、 转染、 稳定整合所需要的遗传信息。 慢病毒包装质粒可提供所 有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗 粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装， 包装好的假 病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中， 离心取得上清液后， 可以直接用于宿主细胞的感染， 目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基 因转导效率， 而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加， 这就为 RNAi ，cDNA 克 隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中， 对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞， 通过病毒介 导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 三、慢病毒载体介绍 慢病毒载体（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系 统，它能高效的将目的基因（或 RNAi ）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基 因组是正链 RNA ，其基因组进入细胞后， 在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ， 形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后， DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录 mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰。 慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干