胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定-2019年文档资料.docVIP

胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定 　　在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物来源 清洁级孕17-19天SD大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。 　　1.2 主要仪器与试剂 CO2培养箱（Thermo公司），倒置相差显微镜为（Olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为ZEISS LSM710，小鼠抗大鼠classⅢβ-Tubulin单抗（Beyotime公司），NSE免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程XX公司），B27添加剂、Neuralbasal、Hoechst 33342Sigma公司），DMEM（高糖型）培养基、胎牛血清（Gibco公司）。 　　1.3 培养方法与鉴定 取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含DMEM的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%CO2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%FBS的DMEM液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。1000r/min离心5min，弃上清，并加入适量的含2%B27无血清Neuralbasal培养基，用巴氏管吹打成细胞混悬液。吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整细胞悬液的细胞密度，以5×105个/ml的细胞密度接种于预先经0.05%多聚赖氨酸包被的6孔板（1.5ml/孔），置于37℃、5%CO2培养箱培养，24h后换培养基继续培养，以后每周更换维持培养基2次，每次半量换液。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。培养7d后用4%多聚甲醛固定，以β-tublinⅢ单克隆抗体荧光染色显示海马神经元，用Hoechst33342复染显示细胞核（具体操作按说明书进行），激光共聚焦显微镜下观察，同一视野用不同的激发光激发并分别摄取细胞和细胞核的荧光图片，利用显微镜自带NIS成像软件将所得图片进行组合。同时，采用传统的NSE细胞免疫化学染色方法，DAB显色，HE复染显示细胞核，倒置相差显微镜下观察拍照。神经元纯度计算方法：在高倍显微镜下随机选取5个视野，计算阳性细胞的个数除以总细胞数，换算成百分率，重复5次，取其均值±标准差作为神经元的纯度。 　　2 结 果 　　2.1 原代培养海马神经元的形态学观察 采用含B27无血清培养胎鼠海马神经细胞，倒置相差显微镜下观察，可见刚接种的海马神经元呈圆形或椭圆形，呈悬浮状态，体积较小、透亮，培养2h后开始贴壁，培养24h后可见存活的细胞基本已都贴壁，培养液内可见少部分漂浮的细胞与残渣，利用换液去除残渣，使背景干净。贴壁细胞形态多呈梭形，生长旺盛，长出长短不一的突起但神经元之间尚未建立明显的连接（图1）。培养3d后，细胞突起增多伸长增粗，细胞间开始形成连接，胞体较饱满，周边有光晕（图2）。4-6d神经细胞生长更加旺盛，胞体继续增大，多呈锥体形，突起增多伸长，且分支很多，粗大，突起交织成网状，形成神经细胞网络（图3）。7-10d神经元胞体饱满，周围光晕明显，突起更多更长，且互相迁移靠近，开始形成集落样神经元群落，突起已形成较稠密的神经纤维网络，此时立体感增强，适合于进行相关研究（图4）。14d后细胞聚集现象明显，且胞体中开始出现空泡，空泡随培养时间延长而增多，细胞开始退化变形（图5）。21d后神经细胞退化明显，细胞核固缩、核碎裂明显，突起退缩、断裂，细胞周围光晕变淡消失（图6）。 　　2.2 原代培养海马神经元纯度鉴定 　　2.2.1 采用经β-tublinⅢ单克隆抗体和Hoechst33342在激光共聚焦显微镜下观察，胞浆和突起呈红色，细胞核呈蓝色，计算其神经元纯度为91.5%±2.8%。 　　2.2.2 利用免疫组化染色试剂盒对神经特异性烯醇化酶进行染色，在倒置相差显微镜下观察，神经细胞胞浆被染成棕黄色，经过苏木素复染后可见神经细胞核被染成紫色。本实验经NSE染色鉴定其神经元纯度为90.8%±3.6%。 　　3 讨 论 　　细胞体外培养技术在基础医学研究中的地位甚为突出，尤其是在神经生物学、药理学、分子生物学研究方面。由于神经细胞不能分