细胞培养技术1.doc

细胞房注意事项 进出细胞房必须换拖鞋，勿将细胞房内拖鞋穿出细胞房，房外拖鞋也不可进入房内。 进入细胞房穿着专用白大褂，勿将一楼动物实验的白大褂带进细胞房。 实验结束后及时清理台面，勿将垃圾留在实验台面。 实验后及时清洗实验用品，勿将要洗的用品留在洗涤盆过夜。 实验后检查显微镜、超净台等实验仪器电源，确定已关方可离开。（显微镜在关闭电源前务必将光源调至最暗） 注射器针头、玻璃等利器扔进利器盒，勿直接丢垃圾桶。 培养瓶等放进培养箱前用75%酒精消毒培养瓶表面，水平放置，若有培养液渗出培养箱，立即用75%酒精擦拭。 若发现细菌等污染，立即将培养瓶丢到黄色垃圾袋中，并及时报告实验室工作人员，以及时对污染区域进行消毒。若培养瓶要回收，应先用消毒水浸泡，再进行常规清洗消毒。 在使用酒精灯过程中，手上酒精挥发干后方可靠近酒精灯操作，切勿将表面有酒精的物品靠近火苗。 细胞培养基本操作 无菌操作基本技术 1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起气溶胶之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 实验用品 1.细胞培养实验用品均为无菌，分玻璃容器和塑料无菌制品。 2.种类：培养瓶，培养皿，多孔培养板，巴氏管，离心管（15ml,50ml）,玻璃血清瓶等。 3.清洗和消毒 3.1．玻璃器皿： A.浸泡：新玻璃器皿，自来水初步清洗；使用后玻璃器皿立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸黏附于玻璃上导致难以清洗。浸泡使器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。 B.刷洗：浸泡后用毛刷加洗涤剂洗涤，刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，晾干。 C.清洁液浸泡：清洁液（重铬酸钾+浓硫酸+蒸馏水配成的次强酸）浸泡，可将玻璃器皿残留未刷干净微量杂质完全清除，浸泡时，应使器皿内部完全充满清洁液，不留气泡，一般浸泡过夜，或起码为6H以上。 D.冲洗：浸泡后器皿流水彻底清洗，每个器皿用流水灌满，倒掉，重复十次以上，直到清洁液完全洗干净，用蒸馏水漂洗2—3次，最后三蒸水漂洗一次，烘干待用。 3.2．塑料器皿：用后立即清水清洗，晾干，2%NaOH浸泡过夜，自来水清洗，5%盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗（浸泡30min）。但塑料用品不宜反复使用次数太多。 3.3.胶塞、盖子等杂物：新的胶塞、盖子等杂物因带有活石粉，自来水洗净后，常规清洗；使用后的浸泡于清水中洗涤剂刷洗；晾干备用。 清洗过的器皿包装后，高压蒸汽灭菌121℃，20min，烤箱烘干。有效期1~2 培养基 1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳， 可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例) 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差， 或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调 整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培 养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 3.2.2. 粉末培养基 3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 3.2.4. 电磁搅拌器 3.2.5. 无菌血清瓶 3.2.6. 0.1