FlowCytometry(流式细胞术)应用于细胞凋亡、细胞周期等方向的方法研究.ppt

流式细胞术 Flow Cytometry 什么是流式细胞仪 1. 发展历史 1934 Moldavan 1973 Steinkamp 2. 定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术. 3. 特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。 凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。 前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发 在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。 基本结构 流动室和液流系统； 激光源和光学系统； 光电管和检测系统； 计算机和分析系统。 三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数 外周全血细胞散射光双参数点图 荧光信号 荧光信号与细胞特性 三 数据处理及流式报告 流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。 几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。 Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。 流式细胞仪数据分析 流式细胞仪数据分析 五、 流式细胞术的应用 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 …… 一） 细胞DNA含量检测 单参数直方图 DNA细胞周期分析 含量与凋亡关系 DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。 二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究 1. 肿瘤诊断 DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。 2. 凋亡研究 在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。 检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。 Annexin V Assay 根据凋亡细胞的特点来检测 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 凋亡细胞的FSC ？SSC ？ 细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，SSC ？ CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。 五） 细胞内蛋白的分析： 细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含量。荧光探针多为FITC。 荧光信号 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 荧光样本制备 端粒（荧光蛋白） 　　 六）细胞内钙离子测定 1×106/ml的细胞悬液， 加入终浓度为1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60分钟。 以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。 六. 分选： 用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟300个细胞， 大型机分选速度可达到每秒上万个细胞 对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜 2倍体 异倍体 4倍体 肿瘤组织中的各种DNA倍体 图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Di