免疫组化免疫荧光.pptVIP

1、有那两种荧光封片剂的现货？他们区别是什么？ 2、我们免疫组化试剂盒的原理？组分？ 3、AlexaFluor荧光二抗的优点？ 抗山羊二抗 抗兔二抗 封片剂 荧光技术最大的问题是信号淬灭，它可能会导致您的结果灵敏度降低，而且您的结果不容易长期保存。 所以您需要Prolong Gold Antifade Reagent。只需滴加一滴于您的样本上，经过固化，荧光强度即可保持至少数月不会明显衰减，适合长期保存您的结果！（试用装还有5个库存） 该产品提供普通即用型包装以及含DAPI 核酸染料的复合包装。 SlowFade? Gold antifade 是水性抗淬灭剂，含甘油，适合切片即时观察，能降低荧光淬灭5 倍。不适合长期保存。 其他辅助产品 荧光免疫注意事项 一抗必须是说明书上表明可以用于IF样本检测的 必须按照说明书推荐固定方法进行标本固定 必须设定阴性（不加抗体或只加二抗）和阳性对照 Millipore CST epitomics 免疫酶酶标法 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位； 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。 常用的标记酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP) 常用的免疫酶染色方法 酶标抗体法 直接法（酶直接标记于一抗） 间接法（酶标记于二抗） 非标记抗体酶法 SP法 ABC法 S-P/LAB方法 ABC方法 比SP法更加敏感，适用于表达量极低难以检测的蛋白 底物显色剂 HRP底物 DAB显色后呈棕褐色 TMB为蓝色 002014 002019 其他辅助产品 谢谢！ 免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次； 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； 2%BSA或10%BSA37?C湿盒内封闭30min 抗体染色： 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37?C孵育30min； 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 缓冲甘油封片 镜检：在荧光显微镜下观察。 1) 酶标抗体法——直接法 ? 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。 (1) 酶标抗体法——间接法 将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 多标记免疫荧光染色法 同一组织片上检测两种或多种抗原 适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片 酶免疫组织化学常用方法 S-P： 二抗 - Biotin + 链酶亲和素-HRP/AP； ABC：亲和素/链酶亲和素-生物素化HRP/AP复合物； 特点：敏感（ 40倍PAP）； 经济（节省一抗） 非Biotin/Avdin方法：二抗直接偶联酶 IF常用标本类型 细胞爬片 冰冻组织切片 石蜡组织切片（建议采用化学显色方法） 1、冰冻组织块的制备 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196?C)中10～20sec； 干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70?C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好； 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 ?C冰箱。 2、切片 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂； 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 ?C 。切片厚度一般为4～8?m。 3、切片后处理 切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4?C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。 取材的特殊要求及注意事项 标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，