人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药.docVIP

人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性[基金项目] [基金项目] 江苏省社会发展科技计划项目（BS2007077），国家自然科学基金资助项目 第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话E-mail： lwjsky1314@126.com 通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话 E-mail： jhzhao2838@ 李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1 (210009 江苏 南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3) [摘要] 目的 建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。方法 采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。结果 经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P0.01）。与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。结论 MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。 [关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白 [中图分类号] R737.9 乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为30-50%[2]。已知耐药细胞株是研究肿瘤MDR发生和逆转的重要模型，国内外报道现已建立多种乳腺癌耐药细胞株，但关于Doc乳腺癌耐药细胞株的建立国内还未见报道。为此，本文通过低剂量逐步加量法体外诱导建立人乳腺癌多西紫杉醇耐药株，并对其生物学及耐药特性进行了初步研究。 1 材料和方法 1.1 材料　乳腺癌细胞株MCF-7/S为典型的雌激素受体（ER）阳性细胞株，分离自人乳腺腺癌组织上皮（上海细胞生物所）；Doc、顺铂和卡铂 (齐鲁制药)，紫杉醇 (太极制药)、多柔比星 (海正药业)、吉西他滨 (豪森药业)、他莫昔芬 (扬子江药业)、甲氨蝶呤和依托泊苷(恒瑞医药)、羟喜树碱 (李时珍药业)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma)；鼠抗人P-gp单克隆抗体(ABcam)；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG (康为生物) 、HRP标记抗兔IgG（博士德生物）。 1.2 细胞培养 MCF-7/S细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM高糖培养液, 在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，经2-3 1.3 MCF-7/Doc的建立 首先测定Doc对MCF-7/S的半数致死浓度(IC50)；以IC50的1/1000 Doc为起始浓度作用MCF-7/S细胞24h，生理盐水洗五遍，撤药常规培养并每天换液去除死细胞，约7-18天后存活细胞生长恢复，待进入对数生长期后传代1次，继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导（梯度为10 ng/ml）；如此反复，历时10个月，直至细胞能在100 ng/ml Doc培养液中稳定地传代生长。双目倒置显微镜下观察各时段细胞的生长情况。 1.4 生长曲线测定 将对数期MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞经胰酶消化后制成2×104单细胞悬液，接种于24孔板，接种后第1～5天计数，每次计数3孔取平均值，绘制生长曲线。按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：Td=Tlg2/lg(NT/N0)，Td为倍增时间(h)，T为细胞数由N0增至NT所用的时间，N为细胞数。 1.5 细胞IC50及耐药指数RI的检测 1.5.1 MCF-7对D