化妆品生产中一种污染菌种的试验室研究.doc

化妆品生产中抗性环境菌株的研究 祝 坤，王晴磊，黄晓青 （伽蓝（集团）股份有限公司研发中心，上海200233） 摘要：研究通过对化妆品生产中的环境菌株进行菌种分离，得到了一株伯克霍尔德属类的环境菌。通过抑菌圈和挑战实验证明，该菌对以双咪唑烷基脲为主要功能成分的防腐体系具有抗性；另外通过去活性物挑战实验，证明了活性物对抗性环境菌在产品中爆发性生长是起关键作用的。通过以上数据，更深入的了解产品微生物污染的来源和机制，对有效预防化妆品生产微生物污染，同时设计更有效的防腐体系提供依据。 关键词：化妆品；抗性菌株；活性物；防腐 中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1006-7264（2014）11-0000-00 DOI：10.13222/j.cnki.dc.2014.11.000 化妆品是日常生活的必需品，但由于化妆品成分复杂，含有的营养物质是微生物生长的良好培养基，导致病原微生物的滋生[1]。因此化妆品的微生物污染问题始终存在，对使用者健康的潜在危害不容忽视。 研究从工厂生产环境中分离出来的一株细菌，同时该菌在某半成品中曾检出。对比了此环境菌和标准菌株对不同产品的挑战数据。通过以上实验和分析，掌握更多化妆品生产过程中环境菌的来源和生长特性，以期建立更有效的微生物控制评价体系和有效的产品防腐配方体系，为进一步提高化妆品防腐效能力提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 快速革兰氏染色试剂盒（上海铭睿生物科技有限公司）、API生化鉴定试剂盒（法国梅里埃试剂公司）、8.5%生理盐水（国药集团化学试剂有限公司）、TSB+30%甘油，大豆胰蛋白琼脂培养基( TSA) （美国BD生物公司）、大豆胰蛋白液体培养基（TSB）（美国BD生物公司）。 1.1.2 生物安全柜（ESCO）、超净台（ESCO）、37℃恒温培养箱（德国BINDER）、28℃恒温培养箱（德国BINDER）、移液器（Eppondorf）、天平(德国赛多利斯)、涡旋振荡器、显微镜（XSP-3CB，上海光学仪器一厂）、250 mL一次性取样杯、刮刀、一次性接种环、酒精灯、载玻片及吸水纸等（以上 1.1 环境菌X分离自工厂环境监控培养平板。标准菌株：大肠杆菌（ATCC 6538）、金黄色葡萄球菌（ATCC 8739）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027）、洋葱伯克霍尔德菌(ATCC 25416)、标准菌种均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。 —————————— 收稿日期：2014-08-06 作者简介：祝 坤（1986-），女，山东人，研究员。 1.2 方法 1.2.1 菌种 用无菌接种环取环境监控平板单菌落划线TSA平板，37℃培养48 h±2 h。用无菌接种环取单菌落于TSB培养基中进行增菌培养48 h±2 h。用TSB+30%甘油保存菌种备用。对检出的菌株进行革兰染色。细菌鉴定采用法国梅里埃生物公司的API生化鉴定试剂条。 1.2.2 制备108 cfu / mL的混合标准菌菌液和X菌液，分别取菌液1 mL于直径150 mm的培养皿中，倒入熔化的45℃左右的TSA培养基100 mL左右，摇动至充分混匀，冷却。用镊子将直径5 mm的圆滤纸片在不同质量浓度的防腐剂溶液中浸渍片刻，取出置于平板上指定位置。盖上盖子，置于37℃下培养24 h 1.2.3 14天快速挑战实验 参考CTFA挑战方法[2]进行改进。制备标准菌株混菌和环境X菌株菌液，取检测样品100 g，接种菌液（108 cfu / mL）各1 mL，用刮刀上下左右充分混匀。置于室温（25℃）下分别于6 h、24 h、27 h、48 h、7天和14天取样1 mL进行梯度稀释计数，取样平板置于37℃恒温培养箱中3天 ~ 2 结果与分析 2.1 菌种分离和鉴定 通过鉴定，分离到的环境菌X菌种为乳白色，半透明，表面光滑湿润的细菌。革兰氏染色阴性，短杆菌。通过API鉴定为伯克霍尔德菌属，其中最有可能的是越南伯克霍尔德氏菌和洋葱伯克霍尔德氏菌。 有研究表明，伯克霍尔德菌属可以在营养极低的环境中生长，广泛存在于土壤和水中[3]。因此可以推断此环境菌X可能来自于生产用水及清洁用水等，主要原因可能在于工厂环境未做好清扫清洁消毒干燥等。 2.2 抑菌圈实验 抑菌圈实验室衡量防腐剂杀菌抑菌效果的一种方法，通过抑菌圈的大小可以判断防腐剂对微生物生长的抑制作用大小。本实验中所选用的防腐剂溶液种类和质量浓度分别如下表1中所列。 表1 抑菌圈实验中使用的防腐剂种类和浓度 Tab.1 Preservatives and concentration used in inhibition zone test Line 成分 浓度1/ mg·kg-1 浓度2/ mg·kg-1 浓度3/ mg·kg-1