第九章 转基因动物与生物反应器.pptVIP

第9章 转基因动物与生物反应器; 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物（transgenetic animal）。;1.转基因牛;;2.转基因绵羊、山羊和猪;在山羊奶中生产ATT;3.转基因禽类;4. 转基因鱼;将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中； 接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使??顺利完成胚胎发育； 移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因； 利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。;外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系;9.1 目的基因的制备;;9.1.2 目的基因的克隆;9.1.3 目的基因的转移; A.电穿孔法 实现外源基因的转移;显微注射转基因技术;C.磷酸钙—DNA共沉淀法;D.脂质载体包埋法;病毒介导的生物学方法;9.2 转基因动物的培育技术;何为显微注射？ 显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。;;将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 从小鼠子代体内取出DNA样品进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点 ； 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。 ;通过DNA显微注射获得转基因小鼠示意图;1. 显微注射DNA的制备与纯化;2. 鼠的准备与要求;3. 超排卵与取卵;制定排卵程序： (1) 于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l 0单位的PMS； (2) 过48小时(第三天中午)腹腔内注入5—10单位的人hCG(注射后11—13 小时后排卵)； (3) 令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再重用，但成功率下降； (4) 检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。;2 受精卵的收集;(4)另准备4—5个平皿，每皿内均充有胚胎培养基400 ?l并覆盖有厚8mm硅烷油或液 体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO2中置37℃1小时做平衡处理。 覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变； ;(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5 ?l新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg／1ml分离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开； (6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用； (7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此时的卵己可用作DNA注射之用。;4. DNA显微注射;;（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡（厚约5mm）； （2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)； （3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；;（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml （5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）把待注射用的DNA装入注射管中；;（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射； 注射细胞数量越多越好； ;（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种； （10