微生物学试验目的与要求.docVIP

PAGE PAGE 10 实验十 病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验 目 的 （一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。 （二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。 （三）了解病毒培养的三种方法。 （四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理 （五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程 内 容 （一）病毒的形态学诊断 1. 病毒的电镜照片（示教） 2. 狂犬病毒包涵体（示教） 3. 麻疹病毒包涵体（示教） （二）病毒的培养法（录像） 1. 病毒的动物接种法 2. 病毒鸡胚培养法 3. 病毒的组织培养法 （三）血凝抑制试验（操作） 病毒的形态学诊断 病毒形态学研究方法可分为两种：一种是应用电子显微镜技术，观察其大小，形态及排列特征，以帮助诊断；另一种是应用光学显微镜通过涂片染色或切片染色，观察包涵体。病毒感染细胞所产生的包涵体，其特征基本是固定的，故对病毒性疾病的诊断具有一定价值。 【方法】 （一）病毒的电镜照片（示教） 观察腺病毒、疱疹病毒的电镜照片，注意其形态结构、大小、排列、及其包膜的形成。 （二）狂犬病病毒内基（Negri）包涵体（示教） 用高倍镜或油镜观察经HE（苏木紫-伊红染色）染色的死于狂犬病的犬脑组织切片，注意包涵体在细胞内的形态、位置及染色性。 （三）麻疹病毒包涵体（示教） 用高倍镜或油镜观察经麻疹病毒培养后，HE染色的人胚或羊膜细胞标本片，注意包涵体在细胞内的位置、形态、染色性以及细胞融合情况。 病毒动物接种法 实验动物在病毒学研究中有四方面用途：①分离鉴定病毒，如乙脑病毒；②连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；③制备抗血清；④病毒致病机理的研究。 常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。 （一）小白鼠尾静脉接种（录像） 【材料】 1. 动物：小白鼠 2. 病毒悬液 3. 碘酒、酒精、二甲苯、无菌0.25ml注射器、4号针头及小铝匣 【方法】 1. 将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必要时用二甲苯擦）使血管扩张。 2. 尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45°，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液0.1毫升。 注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。 接种后逐日观察动物发病情况。 （二）小白鼠鼻内接种（录像） 【材料】 小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、无菌毛细管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。 【方法】 1. 首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎，太浅则易在滴种时打喷嚏。 2. 用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。 3. 用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为0.03～0.05毫升，不宜过多。 4. 小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开始发病，发病的症状常为毛耸、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。 （三）小白鼠脑内接种（录像） 【材料】 脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10％脱脂奶盐水研磨成10－1悬液，然后用3000转/分离心沉淀30分钟，吸取上清液供接种用。 小白鼠：3周龄，体重6～8克。 无菌0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。 【方法】 1. 以无菌0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。 2. 取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小白鼠的体部。 3. 右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。 4. 右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针2～3毫米，不要插得太深，注射量为0.02～0.03毫