缓冲液的配制.docVIP

Elisa 相关试剂的配制 抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO4·2H2O—— 0.39克；Na2HPO4——1.27克； NaCl——0.85克； NaN3——200 mg； H2O（蒸馏水） 至 1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBST NaCl——2.0克； KH2PO4——0.2克； Na2HPO4·12H2O—— 2.9克； KCl——0.2克； NaN3——0.2克； H2O至 1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml； 4°C保存备用 包被液（简称CB）pH9.6 Na2CO3——1.59克； NaHCO3——2.93克； NaN3——0.2克 ；H2O至1000ml 密封盖好，4°C存放备用 4、ELISA底物液（可溶性底物） ?磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0? 0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）——24.3ml；0.2mol/L?Na2?HPO4（28.4克/L)——25.7ml；H2O?——50ml； ?4°C存放备用 ?5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等） 0.05mol/L pH7.6 tris-HCL Tris—— 6.05克；HCL(36%)—— 3.15克（约2.7ml浓HCL）； H2O 至1000ml DAB为3′，3′二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色 ELISA试剂配制及实验流程 是酶联接免疫吸附剂测定((?Enzyme-Linked?Immunosorbnent?Assay?)的简称。以双抗体夹心法举例说明。 ?试剂配制： ?(1)?包被缓冲液(PH9.6?+0.2??0.05M碳酸盐缓冲液)：??Na2CO3——1.59g?;NaHCO3?——2.93g?； 加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA） ?(2)洗涤缓冲液(PH7.4??0.15M?PBST)：0.05%Tween-20——0.5ml；加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：?KH2PO4——0.2g?；Na2PO4·12H2O——2.9g?；NaCl——8g?；KCl——0.2g；?加蒸馏水至1000ml。 ?(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%——2g?；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。 (4）稀释液?：牛血清白蛋白?0.1?%?——0.1g?；加PBS?缓冲液100ml。 (5）?底物缓冲液（PH5.0）：0.2M??Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)?取25.7ml?0.1M?柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸馏水至100ml。?(或Na2HPO4·12H2O——1.84g?；柠檬酸·H2O?——0.51g?加蒸馏水至100ml)? ?(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：TMB(2mg/ml水)——0.05ml；?底物缓冲液——0.95ml；?30%??H2O2 ——0.001ml?；总体积1ml。 (7)?或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉）——0.004g?；底物缓冲液——10ml?；30%?H2O2?——0.015ml?；总体积——10ml。 (8)终止液(2M?H2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。? 操作步骤：? 1.?包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶 液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。? 2.?封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤3次? 3.?加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。? 4.??加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。? ?? 5.?加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。 6.?加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。? 7.?终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色） 8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+