河南大学医学院试验教案.doc

河南大学医学院实验课教案首页 实验名称 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 授课对象 教学目标 学时分配 大体内容与时间安排：(8学时) 掌握血清蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 讲授时间60分钟 理解电泳过程中的三种效应 讲授时间30分钟 讲授时间90分钟 学生操作时间310分钟 授课重点 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 2.制胶、加样、电泳、染色、脱色等基本操作。 授课方法 课前准备 讲授为主，结合提问、总结，指导纠正 教材 《生物化学实验指导》 刘玉庆 主编 人民卫生出版社 教研室审查意见 主任签字 授课教师姓名及职称： 日期： 河南大学医学院实验课教案 实验名称 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 实验目的 1.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理。 2.学会用这种方法测定蛋白质的分子量。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)有连续和不连续电泳之分。不连续盘状电泳有较高的分辨力，这里因为有三种效应：浓缩效应，在样品胶和浓缩胶中进行；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。 (1)浓缩效应：管中置三种不同的凝胶层，即上层为样品胶，第二层为浓缩胶，这两层均为大孔胶、Tris—HCl缓冲液、pH值6．7，第三层为分离胶，该层为小孔胶、Tris—HCl缓冲液、pH值8．9。在上下两电泳槽中充以Tris—甘氨酸缓冲液，pH值8．3。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下，HCl几乎全部电离为C1-，甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白质也能解离带负电荷。当电泳系统通电后．这三种离子都向正极移动，根据有效泳动率的大小，最快的称为快离于或先行离子(这里是Cl-)，最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后，快离子在前，在它的后边形成一离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离孑和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，则在快离于和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 (2)电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分于所载有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。 (3)分子筛效应：当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值8．9(电泳时实际测量是9．5)使接近甘氨酸的pKa值(9．7—9．8)，这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电压梯度不存在了，各种蛋白质仅仅由于其分子量或构象的不同，在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同、受阻滞的程度不同，表现的泳动率不同而被分开 不连续电泳系统PAGE，之所以能将血清中各蛋白质组分分离开，是由于这些分子所带电荷多少不同及分子大小不同之故。如果将电荷差异这一因素除去或减少到可以忽略不计的程度，分子在凝胶上泳动率的大小则完全取决于分子量。 SDS是十二烷基硫酸钠(sodiom dodecyl sulfate，)的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质分子间原有电荷的差异。这样就使蛋白质分子的电泳迁移率只取决于它的分子量的大小这一因素， 而其他影响蛋白质电泳迁移率的因素几乎可以忽略不计。实验证明，在这种情况下电泳迁移率与其分子量的对数之间呈负相关关系。所以将已知分子量的标志蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制得一条校正曲线。在相同条件下，只要测得未知分子量蛋白质的电泳迁移率，即可从校正曲线上求得其近似分子量。 基本操作 仪器介绍 基本操作：凝胶制备、加样、电泳、凝胶分离、染色及结果观察。 设备：圆盘电泳槽,电泳仪 实验步骤 1．电泳凝胶制备 凝胶管下层用7.